Sequence Mapping of sgRNA Digests: Leveraging Xevo™ MRT Mass Spectrometer Performance and Streamlining Data Analysis with MAP Sequence 2.0

Význam tématu

Mapování sekvence štěpných produktů sgRNA pomocí LC-MS je zásadní pro ověření správné konstrukce a integrity terapeutických RNA molekul využívaných v CRISPR-Cas9 gene editingu. Přesná identifikace fragmentů a potvrzení modifikací zajišťují spolehlivost výsledků ve výzkumu i v komerčních aplikacích, zejména při regulovaném vývoji léčivých postupů.

Cíle a přehled studie

Cílem této aplikace bylo ukázat plně automatizované, shodu splňující workflow pro sekvenční mapování štěpných produktů 100merové sgRNA standardní molekuly. Studie demonstruje kombinaci tří enzymatických štěpení (RNáza T1, RapiZyme MC1, RapiZyme Cusativin), akvizici UPLC-MSE dat na hmotnostním spektrometru Xevo MRT a zpracování výsledků v aplikaci MAP Sequence 2.0.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Enzymatické štěpení sgRNA ve třech oddělených reakcích s RNáza T1, RapiZyme MC1 (pH 8, 30 °C, 30 min) a RapiZyme Cusativin (pH 9, 30 °C, 30 min).
• Inaktivace enzymů zahřátím (70–75 °C) a přímá analýza 5 µl injekcí v UPLC-MSE.
• Automatizované in-silico štěpení, přiřazení monoisotopických hmotnosti a fragmentační data v aplikaci MAP Sequence 2.0.

Instrumentace:

• UPLC: ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 300 Å, 1.7 µm, 2.1×150 mm, teplota 70 °C, 400 µl/min, mobilní fáze A (0.1 % DIPEA, 1 % HFIP, pH 8.5), B (0.0375 % DIPEA, 0.075 % HFIP v 65 % ACN).
• MS: Xevo MRT QTOF s ESI(-), režim MSE (low-energy 6 V, high-energy 15–25 V), rozsah 50–4000 m/z, rozlišení 100 000, sub-ppm hmotnostní přesnost.

Hlavní výsledky a diskuse

Každý enzym poskytl jedinečné štěpné vzorce umožňující pokrýt různé části sgRNA:

• RapiZyme Cusativin dosáhl 100 % pokrytí díky cílenému štěpení za cytinovými residui a předvídatelným přeskočením (2–4 chybějící štěpení).
• RapiZyme MC1 pokryl 91 % sekvence štěpením na místě uridinů.
• RNase T1 doplnil pokrytí tam, kde ostatní enzymy neštěpily.

Automatizované přiřazení precizních monoisotopických hmotností a validace fragmentačními ionty vedly k sub-ppm průměrné RMS chybě u prekurzorů i fragmentů. U vybraného 14-meru (U31:U44) byla plná šířka izotopového vzorce i fragmentační mapa detailně analyzována.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a spolehlivá kontrola kvality syntetických sgRNA v laboratořích a při výrobě léčiv.
• Plně automatizované workflow minimalizuje subjektivní zásahy a zrychluje interpretaci dat.
• Kompliance-ready platforma waters_connect podporuje audit a regulované prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší využití této metodiky pro další typy RNA terapeutik (siRNA, mRNA vakcíny). Integrace dalších specifických ribonukleáz a kombinace s dalšími modifikacemi RNA rozšíří sekvenční pokrytí a detekční citlivost. Dále se předpokládá další automatizace na bázi strojového učení pro zpracování složitějších vzorků a multiplexních analýz.

Závěr

Prezentovaný workflow spojuje enzymatické štěpení, špičkové UPLC-MSE měření na Xevo MRT a automatizovanou analýzu v MAP Sequence 2.0, což umožňuje rychlé a přesné mapování sekvence a modifikací sgRNA s 100 % pokrytím a sub-ppm přesností.

Reference

1. Jinek M. et al. Science 2012, 337, 816–821.
2. Jiang F., Doudna J.A. Annu Rev Biophys 2017, 46, 505–529.
3. Ganbaatar U., Liu C. Front Cell Infect Microbiol 2021, 11, 663949.
4. Goyon A. et al. Anal Chem 2022, 93, 14792–14801.
5. Grunberg S. et al. Protein Expr Purif 2022, 190, 105987.