Oligo Mapping of sgRNA Digests: Leveraging Xevo MRT Mass Spectrometer Performance and Streamlining Data Analysis

Význam tématu

Analýza a mapování trávených produktů single-guide RNA (sgRNA) je klíčová pro ověření kvality a funkční integrity molekul používaných v CRISPR-Cas9 technologiích. Detailní charakterizace štěpných fragmentů pomocí LC-MS a pokročilých bioinformatických nástrojů umožňuje spolehlivé sledování přesnosti sekvence, rozhodujícího parametru pro výzkum i klinické aplikace v oblasti genové editace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo představit validovatelný a plně sledovatelný pracovní postup pro oligo mapování trávených produktů sgRNA. Workflow zahrnuje enzymatickou přípravu s ribonukleázou RapiZyme MC1, akvizici dat pomocí UPLC-MSE na hmotnostním spektrometru Xevo MRT a automatizovanou analýzu v prostředí waters_connect s aplikacemi MAP Sequence a CONFIRM Sequence.

Použitá metodika a instrumentace

Enzymatické trávení:

• RapiZyme MC1 při 30 °C po dobu 30 minut
• 50 µM sgRNA standard v pufru 200 mM NH₄OAc, pH 8,0

Chromatografie a hmotová spektrometrie:

• UPLC: ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 (2,1×150 mm, 1,7 µm), 70 °C, 400 µL/min
• Eluce gradientem 0,1% DIPEA/1% HFIP ve vodě a 0,0375% DIPEA/0,075% HFIP v 65% acetonitrilu
• Injektovaná objem: 5 µL, teplota vzorku 8 °C
• MS: Xevo MRT (MRT-TOF QTOF), ESI(-), MSE režim, akviziční rychlost 2 Hz, rozlišení ~100 000, hmotnostní rozsah m/z 50–4000

Bioinformatika:

• Platforma waters_connect verze 4.1.0.17
• mRNA Cleaver MicroApp verze 1.1.0 pro in silico štěpení
• MAP Sequence App verze 1.0 pro přiřazení monoisotopických hmot
• Coverage Viewer MicroApp verze 2.0.0 pro vizualizaci pokrytí sekvence
• CONFIRM Sequence App pro rozlišení izomerů na základě MS² fragmentace

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí RapiZyme MC1 a Xevo MRT bylo dosaženo 100% unikátního pokrytí sekvence 100-mer sgRNA standardu na základě sub-ppm přesností monoisotopických hmot. Multi-odražková technologie umožnila vysokou citlivost, rychlost a rozlišení. Automatizovaná analýza v MAP Sequence App rychle identifikovala trávené produkty a CONFIRM Sequence App úspěšně rozlišila strukturální izomery díky 100% pokrytí MS² fragmentace.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivé ověření integrity a identity sgRNA
• Podpora regulované dokumentace díky integrované informatikě
• RapiZyme MC1 umožňuje generovat překrývající se fragmenty pro kompletní pokrytí
• Rozlišení izomerních sekvencí v jednoznačné varianty
• Zrychlení a automatizace datové analýzy pro vysokou propustnost

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření pracovního postupu na mapování modifikací mRNA a dalších terapeutických oligonukleotidů. Integrace umělé inteligence pro pokročilé vyhodnocení fragmentačních dat a online monitorování kvality v reálném čase by mohla dále zvýšit efektivitu a spolehlivost QC procesů v biotechnologickém průmyslu.

Závěr

Popsaný workflow kombinuje špičkovou instrumentaci a sofistikovanou bioinformatiku k dosažení úplného a jednoznačného mapování trávených produktů sgRNA. Přístup nabízí vysokou přesnost, plnou sledovatelnost a významně zrychluje analýzu, což je klíčové pro výzkum i průmyslové nasazení CRISPR technologií.

Reference

• Jinek M, Chylinsky K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 2012;337:816–821.
• Jiang F, Doudna JA. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annu Rev Biophys. 2017;46:505–529.
• Ganbaatar U, Liu C. CRISPR-Based COVID-19 Testing: Toward Next Generation Point of Care Diagnostics. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:663949.
• Waters Corporation. LC-MS Analysis of siRNA, Single Guide RNA and Impurities using the BioAccord System with ACQUITY Premier System and New Automated INTACT Mass Application. Application Note. 2022;720007546.
• Goyon A, Scott B, Kurita K, et al. Full Sequencing of CRISPR/Cas9 Single Guide RNA (sgRNA) via Parallel Ribonuclease Digestions and Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography High-Resolution Mass Spectrometry Analysis. Anal Chem. 2022;93:14792–14801.
• Waters Corporation. RNA Digestion Product Mapping Using an Integrated UPLC-MS and Informatics Workflow. Application Note. 2024;720008553.
• Waters Corporation. Tunable Digestion of RNA Using RapiZyme RNases to Confirm Sequence and Map Modifications. Application Note. 2024;720008539.
• Waters Corporation. Oligo Mapping of mRNA Digests Using a Novel Informatics Workflow. Application Note. 2025;720008677.
• Waters Corporation. Analysis of mRNA Cap Impurity Profiles and Capping Efficiency Using RapiZyme MC1 Ribonuclease. Application Note. 2025;720008793.
• Grunberg S, Wolf EJ, Jin J, et al. Enhanced Expression and Purification of Nucleotide-specific Ribonucleases MC1 and Cusativin. Protein Expr Purif. 2022;190:105987.
• Thakur P, Atway J, Limbach PA, Addepalli B. RNA Cleavage Properties of Nucleobase-Specific RNase MC1 and Cusativin Are Determined by the Dinucleotide-Binding Interactions in the Enzyme-Active Site. Int J Mol Sci. 2022;23:7021.
• Waters Corporation. CONFIRM Sequence: A Waters_connect Application for Sequencing of Synthetic Oligonucleotide and Their Impurities. Application Note. 2022;720007677.