Preparation of peptide N-Glycosidase F digests for HPAE-PAD analysis

Význam tématu

Glykosylace patří mezi klíčové posttranslační modifikace eukaryotických proteinů a významně ovlivňuje biologickou aktivitu glykoproteinů. V biotechnologickém i farmaceutickém průmyslu je potřeba důkladně charakterizovat a monitorovat strukturu N-vázaných oligosacharidů, aby byla zajištěna konzistentní kvalita a účinnost terapeutických proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout efektivní protokol pro enzymatickou přípravu digesátu glykoproteinů pomocí peptidové N-glykosidázy F (PNGase F) a následné vyčištění vzorku pro analýzu vysoce výkonnou aniontovou chromatografií s pulzní amperometrií (HPAE-PAD) na koloně CarboPac PA200.

Použitá metodika a instrumentace

Ultramoderní chromatografický systém zahrnoval Dionex ICS-3000 nebo ICS-5000 s jednotkami SP/DP čerpadla, elektrochemický detektor a kartridž CarboPac PA200 (3 × 250 mm) s ochranou kolonkou (3 × 30–50 mm). Jako autosampler se doporučila chladicí lišta a pro předúpravu vzorku byly použity spin-columns pro odstranění solí (7 kDa MWCO) a detergentů. Přístroje doplňovala centrifuga Eppendorf série 5400. Reagencie zahrnovaly PNGase F (včetně denaturačního a G7 pufru), 100 mM NaOH, 1 M acetát sodný, NP40, SDS, β-merkaptethanol a standardní oligosacharidové standardy.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Analýza fetuinu ukázala tři rodiny sialylovaných oligosacharidů (di-, tri- a tetrasialylované) rozlišené na CarboPac PA200.
2. U humaního transferrinu bez denaturace PNGase F neuvolnil di-sialylované formy, zatímco po denaturaci vrstvou SDS/BME a přídavkem NP40 následné ošetření spin-columns došlo k úplnému uvolnění a separaci 55 % mono- a 45 % di-sialylovaných oligosacharidů.
3. Spin-columns zajistily ≥ 95 % odstranění solí a detergentů (< 1000 Da) bez významné ztráty oligosacharidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a šetrná enzymatická de-glykosidace i strukturálně komplikovaných glykoproteinů.
• Efektivní jedno- až několikamikrogramové vzorky pro vysoce výkonné oddělení a detekci.
• Minimalizace nežádoucích aniontových rušivých látek (solí, detergentů) zajišťuje vysokou životnost kolony a reprodukovatelnost měření.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se implementace automatizovaných pracovních postupů pro vysokopropustné glykomické analýzy, integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní strukturní charakterizaci a vývoj nových enzymů pro specifické odštěpování O-vázaných oligosacharidů. Další směřování zahrnuje aplikace v klinické glykomice a kvalitativní kontrolu nových bioterapeutik.

Závěr

Popisovaný protokol spojuje enzymatickou detekci N-glykanů PNGase F s účinným čištěním spin-columns a HPAE-PAD analýzou na CarboPac PA200. Výsledkem je spolehlivá, citlivá a reprodukovatelná metoda vhodná pro výzkum i rutinní kontrolu glykoproteinových produktů.

Reference

1. Varki A. Biological Roles of Oligosaccharides: All of the Theories Are Correct. Glycobiology 1993, 3, 97–130.
2. Hardy MR; Rohrer JS. High-pH Anion-Exchange Chromatography (HPAEC) and Pulsed Amperometric Detection (PAD) for Carbohydrate Analysis. In Comprehensive Glycoscience; Kamerling JP, Ed.; Elsevier 2007, Vol. 2, pp. 303–327.
3. Packer NH; Lawson MA; Jardine DR; Redmond JW. A General Approach to Desalting Oligosaccharides Released from Glycoproteins. Glycoconjugate Journal 2004, 15, 737–747.
4. Dionex Corporation. Determination of Plant-Derived Neutral Oligo- and Polysaccharides Using the CarboPac PA200. Application Update 150, LPN 1779, 2005.
5. Dionex Corporation. Separation of Asparagine-Linked (N-Linked) Oligosaccharides from Human Polyclonal IgG Using the CarboPac PA200 Column. AN 215, LPN 2141, 2009.
6. Rohrer J; Avdalovic N. Separation of Human Serum Transferrin Isoforms by High-Performance Pellicular Anion-Exchange Chromatography. Protein Expression Purif. 1996, 7, 39–44.
7. Dionex Corporation. Glycosylation Analysis of Human Serum Transferrin Glycoforms Using Pellicular Anion-Exchange Chromatography. AN 105, LPN 0658, 2002.