HPAE-PAD profiling of N-linked oligosaccharides from glycoproteins using dual eluent generation cartridges

Význam tématu

Glykování proteinů ovlivňuje farmakokinetiku, stabilitu a aktivitu bioterapeutik, proto je analýza N-vázaných oligosacharidů klíčová pro kontrolu kvality a vývoj biopharma produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat provozní režim Dual Eluent Generation Cartridge (Dual EGC) pro HPAE-PAD analýzu N-vázaných glykanů u modelových glykoproteinů (human IgG, AGP). Studie porovnala výkon oproti tradičnímu manuálnímu přípravě NaOH/NaOAc eluenta a ukázala stabilitu, přesnost a přínosy automatizovaného generování eluenta.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografické podmínky:

• Systém: Thermo Scientific Dionex ICS-6000 HPIC s RFIC-EG Dual EGC režimem
• Kolona: Dionex CarboPac PA200 guard (1×50 mm) + analytická (1×250 mm), 1 mm formát
• Eluent: elektrolyticky generované KMSA/KOH kartridžemi (EGC 400 MSA + EGC 400 KOH)
• Gradienty: specifické rampy KMSA a KOH pro IgG i AGP (0,3–42 mM KMSA v 65–90 mM KOH)
• Detekce: pulzní amperometrie na Au/PTFE elektrody, Ag/AgCl referenční elektroda
• Teplota: 30 °C (detektor i kolona pro IgG), 25 °C kolona pro AGP
• Průtok: 0,063 mL/min, injekce 0,4 µL

Průprava vzorků:

• Uvolnění glykanů: Rapid PNGase F (jednostupňový protokol, 50 °C, 2 h)
• Čištění: SPE HyperSep Hypercarb, eluace 40 % MeCN/0,1 % TFA
• Enzymatické štěpení: α2-3,6,8 neuraminidáza (1 h, 37 °C), α1-2,4,6 fukosidáza O (8–60 h, 37 °C)

Hlavní výsledky a diskuse

Dual EGC umožnil separaci neutrálních i sialylovaných IgG glykanů srovnatelnou s NaOH/NaOAc eluenty, rozlišení hlavních N-vázaných struktur (G0F, G1F, G2F, Neu5Ac). Neuraminidáza potvrdila sialylaci odstraněním nabitých piků. Fukosidáza odhalila časový průběh defukosylace (kompletní za 60 h). Pro AGP byly zachyceny bi-, tri- a tetra-antennární struktury, rozdíly v profilech od různých dodavatelů a účinek neuraminidázy na komplexitu chromatogramu. Reprodukovatelnost retence i ploch byla potvrzena opakovanými injekcemi (RSD retencí <1 %).

Přínosy a praktické využití metody

Dual EGC:

• Odstraňuje manuální přípravu eluenta, zkracuje přípravu metody
• Zaručuje konstantní čistotu a stabilitu pH
• Zvyšuje přesnost a reprodukovatelnost mezi laboratořemi
• Minimalizuje kontaminaci a kolona není vystavena nečistotám octanu sodného

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizované generování eluenta lze rozšířit na vysokopropustné a miniaturizované formáty, integraci s hmotnostní spektrometrií pro strukturální analýzu glykanů a širší škálu glykoproteinů v biotechnologii a klinické diagnostice.

Závěr

Dual EGC režim na Dionex ICS-6000 s CarboPac PA200 poskytuje spolehlivou a vysoce reprodukovatelnou separaci N-vázaných oligosacharidů u modelových glykoproteinů, eliminuje ruční přípravu eluenta a zjednodušuje metodický vývoj.

Reference

1. Rohrer JS, Basumallick L, Hurum DC. Glycobiology 2016;26:585–591.
2. Thermo Fisher Scientific. Dionex ICS-6000 Dual EGC Installation Guide. Doc. No 065760-01, 2018.
3. Thermo Fisher Scientific. Dionex ICS-6000 Operator’s Manual, Section 4.1.2. Doc. No. 22181-97002, 2018.
4. Thermo Scientific Technical Note 110: Carbohydrate Determination by HPAE-PAD. 2011.
5. Hardy MR, Townsend RR. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:3289–3293.
6. Rohrer JS. Glycobiology. 1995;5:359–360.
7. Thermo Scientific Application Update 72829: HPAE-PAD analysis of N-linked glycans, 2018.