Evaluating Protein Glycosylation in Limited-Quantity Samples by HPAE-PAD

Význam tématu

Glykozylace proteinů představuje klíčový proces ovlivňující funkci a patologii biologických systémů, zejména v kontextu karcinogeneze. Studium změn oligosacharidové složky, včetně sialylace, fukosylace a větvení glykanů, otevírá cestu k identifikaci nových biomarkerů. Pro klinickou i výzkumnou praxi jsou zásadní metody umožňující analýzu těchto modifikací z omezeného množství vzorku bez nutnosti časově náročné derivatizace.

Cíle a přehled studie

Cílem této práce bylo navrhnout a optimalizovat dva přístupy pro hodnocení N- a O-glykozylace v množstvích proteinu <10 µg pomocí vysokovýkonné aniontové výměnné chromatografie s pulzní amperometrickou detekcí (HPAE-PAD). První metoda sleduje uvolněné N-glykany po enzymatické digesci PNGázou F, druhá určuje monosacharidovou skladbu po acidické hydrolýze za účelem detekce O-glykanů.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický systém: Thermo Scientific Dionex ICS-3000/5000 s eluentním generátorem EGC III, pulzním amperometrickým detektorem ED a autosamplerem AS.
Kolony:

• CarboPac PA200 Guard (3×50 mm) a Analytical (3×250 mm) pro oligosacharidy
• CarboPac PA20 (3×150 mm) a AminoTrap (3×30 mm) pro monosacharidy

Další vybavení: NanoDrop 2000c, SpeedVac SPD131DDA, mikrofiltrační filtry MWCO 10 kD/30 kD, centrifugy, reagencie (PNGáza F, neuraminidasy, α-L-fukosidasa) a standardy monosacharidů a glykanů.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Monosacharidová analýza acidickou hydrolýzou prokázala přítomnost galaktosaminu a glukosaminu u transferrinu s přídavkem mukinu, zatímco PSA vykazovalo poměr 0,07 mol galaktosaminu/glukosaminu obdobný po celkové hydrolýze i po uvolnění N-glykanů, což vylučuje významné O-glykozylace PSA.
2. Gradienty NaOH/acetátu na kolónách PA200 umožnily separaci neutralních (G0, G1F, G2F, G2bF) a nabitých (mono- a disialylované glykany A1F, A2F) struktur z uvolněných glykanů transferrinu, IgG i PSA.
3. Neuraminidazová digesce (α2-3 a α2-6) prokázala kombinovanou sialylaci vazbou α2-3/α2-6 s odhadovaným uvolněním 6,4 mol Neu5Ac/mol PSA.
4. Fukosidázová digesce odhalila převládající α1-6 fukosylaci (zejména u G1F, G2F), potvrzenou změnami retence a relativními plochami chromatografických špiček.
5. Porovnání s literaturou ukázalo obdobné zastoupení nabitých glykanů na PSA i přes mírné odlišnosti v procentuálním rozložení jednotlivých forem.

Přínosy a praktické využití metody

Metody HPAE-PAD popsané v této práci umožňují:

• Analýzu N- i O-glykozylace z velmi malých objemů (0,5–1,6 µg proteinu na injekci).
• Detekci bez derivatizace s minimalizací rizika redispozice vazeb či ztráty sialové kyseliny.
• Rychlou a nákladově efektivní práci v prostředí QA/QC i v akademickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciál dalšího rozšíření zahrnuje spojení HPAE-PAD s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci glykanových izomerů, plnou automatizaci přípravných kroků a vysokoprůchodové glykomické analýzy. Standardizace metod a validace v klinických laboratořích mohou urychlit zavádění glykomických biomarkerů do praxe.

Závěr

Navržené HPAE-PAD metody pro analýzu N- i O-glykozylace prokázaly vysokou citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost při práci s omezeným vzorkovým množstvím. Přímá detekce glykanů bez derivatizace výrazně zkracuje dobu analýzy a snižuje náklady, což otevírá nové možnosti pro glyko­biomarkerový výzkum i rutinní kontrolu kvality.

Reference

• 1. The UniProt Consortium. Reorganizing the Protein Space at the Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 2012, 40, D71–D75.
• 2. Bélanger A. et al. Molecular Mass and Carbohydrate Structure of Prostate Specific Antigen: Studies for Establishment of an International PSA Standard. Prostate 1995, 27, 187–197.
• 3. Li Y.; Tian Y.; Rezai T. et al. Simultaneous Analysis of Glycosylated and Sialylated Prostate-Specific Antigen Revealing Differential Distribution of Glycosylated PSA Isoforms in Prostate Cancer Tissues. Anal. Chem. 2011, 83, 240–245.
• 4. Tabares G. et al. Different Glycan Structures in PSA from Prostate Cancer Sera in Relation to Seminal Plasma PSA. Glycobiology 2006, 16, 132–145.
• 5. Fukushima K.; Satoh T.; Baba S.; Yamashita K. α1,2-Fucosylated and β-N-Acetylgalactosaminylated PSA as an Efficient Marker of Prostatic Cancer. Glycobiology 2012, 20, 452–460.
• 6. Yi W. et al. Phosphofructokinase 1 Glycosylation Regulated Cell Growth and Metabolism. Science 2012, 337, 975–980.
• 7. Valenzuela H.F. et al. O-Glycosylation Regulated LNCaP Prostate Cancer Cell Susceptibility to Apoptosis Induced by Galectin-1. Cancer Res. 2007, 67, 6155–6162.
• 8. Hart G.W.; Housley M.P.; Slawson C. Cycling of O-linked β-N-Acetylglucosamine on Nucleocytoplasmic Proteins. Nature 2007, 446, 1017–1022.
• 9. Dionex Application Update 141. Improved Long-Term Stability of N-Acetylneuraminic Acid Peak Area Responses Using Waveform A. 2000.
• 10. Dionex Technical Note 71. Eluent Preparation for HPAE-PAD. 2007.
• 11. Dionex Application Update 176. Preparation of PNGase F Digests for HPAE-PAD. 2010.
• 12. Dionex Application Note 215. Separation of N-Linked Oligosaccharides from Human IgG Using CarboPac PA200. 2009.
• 13. Thermo Scientific Technical Note 40. Glycoprotein Monosaccharide Analysis Using HPAE-PAD with Eluent Generation. 2012.
• 14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), 5th Edition. CDC 2009.
• 15. Spik G. et al. Studies on Glycoconjugates LXIV. Complete Structure of Human SeroTransferrin Carbohydrate Units. FEBS Lett. 1975, 50, 296–299.
• 16. Fu D.; von Halbeek H. N-Glycosylation Site Mapping of Human Serotransferrin by Lectin Affinity Chromatography and NMR. Anal. Biochem. 1992, 206, 53–63.
• 17. CFG Nomenclature for Representation of Glycan Structure. Functional Glycomics Gateway, 2012.
• 18. UniProt Entry P12021. Porcine Mucin. Nucleic Acids Res. 2012.
• 19. Zheng T.; Rohrer J.; Rao S. N-Linked Oligosaccharide Separation: New Method for Neutral and Sialylated Glycans. GEN Genetic Engineering & Biotechnology News 2010, 30.
• 20. Grey C. et al. Development of HPAE Analysis for Oligosaccharide Mapping. J. Chromatogr. B 2009, 877, 1877–1832.
• 21. Peracaula R. et al. Altered Glycosylation Pattern Distinguishes PSA from Normal and Tumor Origins. Glycobiology 2003, 13, 457–470.
• 22. Tajiri M.; Ohyama C.; Wada Y. Oligosaccharide Profiles of PSA in Free and Complexed Forms: A Glycopeptide Approach. Glycobiology 2008, 18, 2–8.