Glycosylation Analysis of Human Serum Transferrin Glycoforms Using Pellicular Anion-Exchange Chromatography

Význam tématu

Glykozylace a sialylace bílkovin hrají klíčovou roli v biologické funkci a diagnostice onemocnění. Profilování glykoform lidského sérového transferinu (HST) umožňuje sledovat změny ve stupni sialylace spojené s patologiemi jako rakovina, revmatoidní artritida či alkoholová hepatopatie.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje postup frakcionace a analýzy sialylovaných glykoform HST. Hlavním cílem bylo rozdělit transferin na populace odlišné stupněm sialylace pomocí pelikulární anion-výměnné chromatografie a charakterizovat uvolněné oligosacharidy prostřednictvím HPAE-PAD.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrarychlá frakcionace:

• Pellicularní anionměnič DNAPac PA-100 (analytická 4×250 mm, semipreparativní 9×250 mm).
• Gradientní pumpa GP50 a detektory AD20 (UV, 215 nm) a ED40 (pulsní amperometrie).
• Autosampler AS3500, řídicí software PeakNet.

Post-separační analýza:

• PNGase F pro odštěpení N-vázaných oligosacharidů.
• Neuraminidáza pro odstraňování terminálních sialových zbytků.
• HPAE-PAD na CarboPac PA-100 kolóně pro rozlišení mono-, di- a trisialylovaných oligosacharidů.
• Zvrtně-fázová HPLC na Zorbax RP300-C18 pro potvrzení integrity proteinu.

Hlavní výsledky a diskuse

Frakcionací HST na semipreparativní DNAPac PA-100 byly izolovány tři hlavní populace (F1, F2, F3) s rozdílnou retencí. Reversed-phase HPLC potvrdila chemickou podobnost proteinového jádra napříč frakcemi. PNGase F uvolnil oligosacharidy, které HPAE-PAD ukázala jako:

• F1: ~30 % monosialylovaných, 70 % disialylovaných druhů.
• F2: >95 % disialylovaných druhů.
• F3: ~10 % trisialylovaných, 90 % disialylovaných druhů.

Neuraminidázová digesce potvrdila identitu sialylovaných druhů a umožnila spolehlivé odlišení odezvy mono-, di- a trisialylu.

Přínosy a praktické využití metody

Protokol umožňuje rychlou frakcionaci glykoform z malých i větších vzorků, poskytuje kvantitativní odhad distribuce sialylovaných druhů a lze jej aplikovat v klinické diagnostice či farmaceutickém vývoji pro sledování glykozylace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda může být rozšířena o hyphenované techniky hmotnostní spektrometrie pro detailní strukturální analýzu. Potenciál vidíme v automatizaci, vyšším rozlišení i v aplikaci na jiné klinicky významné glykoproteiny.

Závěr

Kombinace pelliculární anion-výměnné chromatografie a HPAE-PAD je efektivní pro detailní profilaci sialylace HST. Postup poskytuje reproducibilní frakcionaci a kvantitativní analýzu glykoform s potenciálem širokého průmyslového a klinického nasazení.

Reference

1. Rohrer J., Avdalovic N. Protein Expr. Purif. 1996, 7, 39–44.
2. Rohrer J. J. Chromatogr. 1994, 667, 75–83.
3. Townsend R.R., Hardy M.R. Glycobiology 1991, 1, 139–147.
4. Rohrer J.S., Cooper G.A., Townsend R.R. Anal. Biochem. 1993, 212, 7–16.
5. Weitzhandler M. et al. J. Biol. Chem. 1993, 268, 5121–5130.
6. Schade A.L., Caroline L. Science 1946, 104, 340.
7. Spik G. et al. FEBS Lett. 1975, 50, 296–299.
8. Dorland L. et al. FEBS Lett. 1977, 77, 15.
9. Wong K.-L., Regoeczi E. Int. J. Pept. Protein Res. 1977, 9, 241.
10. Spik G. et al. FEBS Lett. 1985, 183, 65–69.
11. Campion B. et al. Eur. J. Biochem. 1989, 184, 405–413.
12. van Eijk H.G. et al. Clin. Chim. Acta 1987, 165, 141–145.
13. Storey E.L. et al. Lancet 1987, 1, 1292–1293.
14. Townsend R.R. et al. Anal. Biochem. 1989, 182, 1–8.