Separation of Asparagine-Linked (N-Linked) Oligosaccharides from Human Polyclonal IgG Using the CarboPac PA200 Column

Význam tématu

Charakterizace N-vázaných oligosacharidů glykoproteinů je klíčová pro vývoj bioterapeutik a kontrolu kvality. Rozdíl v glykosylaci může ovlivnit farmakokinetiku, účinnost a imunogenicitu proteinových léčiv. Precizní chromatografické metody tedy hrají zásadní roli při zajištění konzistence a bezpečnosti bioproduktů.

Cíle a přehled studie / článku

Publikace demonstruje využití aniontově-výměnné HPAE-PAD chromatografie s kolónou CarboPac PA200 pro separaci a profilaci N-vázaných oligosacharidů u lidského polyklonálního IgG. Cílem je prokázat vyšší rozlišení, snížení spotřeby elučního pufru a možnost detailní analýzy složitých glykánových miesí oproti předchozím kolónám CarboPac PA100.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém ICS-3000 s pumpou SP, detektorem DC a autosamplerem AS
• Elektrochemický detektor s použitím zlaté pracovní elektrody a Ag/AgCl referencí
• Systém řízení Chromeleon 6.8
• Centrifuga Eppendorf 5400, SpeedVac evaporátor, ohřívaná vodní lázeň, vakuová pumpa
• Kolóna CarboPac PA200 analytická (3 × 250 mm) a ochranná (3 × 50 mm)
• Eluenty: 100 mM NaOH (A) a 100 mM NaOH/0,5 M CH3COONa (B) s gradientem 0–5 min: 99 % A/1 % B; 5–60 min: 1→36 % B
• Průtok 0,5 mL/min, teplota kolóny 30 °C, objem injekce 9 µL
• Enzymatické štěpení: PNGase F, Endo H, neuraminidáza, β-galaktosidáza pro odhalení sekundární struktury oligosacharidů

Hlavní výsledky a diskuse

Menší velikost pryskyřičných a latexových částic v PA200 vedla k výrazně vyšší účinnosti a lepšímu rozlišení glykánových píků ve srovnání s PA100. Snížený průtok a nižší spotřeba acetátu zrychlují on-line desalinaci a omezují množství odpadu. Analýza N-vázaných oligosacharidů z lidského polyklonálního IgG a fetuin ukázala efektivní oddělení biantennárních struktur s terminálními galaktózovými a sialovými zbytky.
Exoglykozidázové digesce umožnily identifikaci terminálních Neu5Ac a galaktózy, biantennárních a disiantennárních variant a přítomnost core-fukosy. Příprava enzymů bez glycerolu minimalizovala přetížení kolóny a zachovala vyšší ostrost píků.

Přínosy a praktické využití metody

• Detekce a rozlišení i blízkých izomerů glykánů s vysokou citlivostí
• Zvýšená účinnost a rychlejší on-line desalinace
• Nižší spotřeba elučního pufru a menší odpad
• Rutinní kontrola glykozylace rekombinantních proteinů v QA/QC laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace koncentrace NaOH pro zvýšení rozlišení
• Integrace HPAE-PAD s hmotnostní spektrometrií pro detailní strukturální analýzu
• Vývoj nových pryskyřic a menších částic pro ještě vyšší účinnost
• Automatizace pracovních postupů a strojové učení pro pokročilou analýzu dat

Závěr

CarboPac PA200 v kombinaci s HPAE-PAD poskytuje významné zlepšení separace N-vázaných oligosacharidů oproti předchozím řadám kolón, zejména u komplexních vzorků jako je lidské polyklonální IgG. Metoda zajišťuje robustní, citlivou a efektivní glykoform profilaci klíčovou pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

• Hardy MR, Townsend RR. Separation of Positional Isomers of Oligosaccharides and Glycopeptides by HPAE-PAD. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988;85:3289–3293.
• Dionex Corporation. Determination of Plant-Derived Neutral Oligo- and Polysaccharides; Application Note 67, LPN 1474; Sunnyvale, CA, 2003.
• Dionex Corporation. Glycoprotein Oligosaccharide Analysis Using High-Performance Anion-Exchange Chromatography; Technical Note 42, LPN 0932; 1997.
• Hardy MR, Rohrer JS. High-pH Anion-Exchange Chromatography and Pulsed Amperometric Detection for Carbohydrate Analysis. In: Comprehensive Glycoscience. Vol 2. 2007.
• Dionex Corporation. Determination of Plant-Derived Neutral Oligo- and Polysaccharides Using the CarboPac PA200; Application Update 150, LPN 1779; Sunnyvale, CA, 2005.
• Dionex Corporation. Optimal Settings for Pulsed Amperometric Detection of Carbohydrates Using the Dionex ED40; Technical Note 21, LPN 034889-03; 1998.
• Dionex Corporation. Eluent Preparation for HPAE-PAD; Technical Note 71, LPN 1932-01; 2007.
• Weitzhandler M, Hardy M, Co MS, Avdalovic N. Analysis of Carbohydrates on IgG Preparations. J. Pharm. Sci. 1994;83:1670–1675.
• Rohrer JS. Empirical Relationships Between Oligosaccharide Structure and Chromatographic Retention. Glycobiology. 1995;5:359–360.
• Cooper GA, Rohrer JS. Separation of Neutral Asparagine-Linked Oligosaccharides by HPAE-PAD. Anal. Biochem. 1995;226:182–184.