Take a peek inside your AAV capsid with Stunner

Význam tématu

Adeno‐asociované viry (AAV) jsou klíčové vektorové platformy pro genovou terapii. Jejich rychlá a spolehlivá kvantifikace – zejména stanovení celkového počtu virových částic, poměru prázdných a plných kapsid a míry agregace – je nezbytná pro vývoj, výrobu a kontrolu kvality (QA/QC) genových vektorů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předkládané studie je demonstrovat schopnosti přístroje Stunner, který v jednom kroku kombinuje UV/Vis spektroskopii, statické a dynamické rozptylové metody (SLS, DLS) pro rychlou (cca 1 minuta) a minimálně objemovou (2 µl) analýzu AAV titrů, prázdných/plných poměrů, agregace a volných proteinů či DNA.

Použitá metodika a instrumentace

Monofonní experimenty probíhaly se sérotypy AAV2, AAV5 a AAV9 (kompletní/empty) ředěnými na 1×10¹²–1×10¹³ cp/mL ve vybraných pufrech (PBS pH 7, citrate‐fosfát pH 4) s 0,001 % Pluronic F68.
Prokazování počtu genomů využilo SYBR Gold fluorescenční test po denaturaci capsidů.
Instrumentace:

• Stunner – kombinace UV/Vis spektroskopie, DLS a SLS
• Fluorescenční 96­-well čtečka pro SYBR Gold
• SBS mikroobjemové destičky pro automatizaci

Hlavní výsledky a diskuse

1) Validace proti ELISA a SYBR Gold:

• Celkové titry SLS/DLS+UV/Vis vs. ELISA: lineární závislost R² > 0,98.
• Titry zapouzdřené DNA vs. SYBR Gold: korelace R² > 0,99.

2) Prázdné vs. plné kapsidy:

• Přesnost stanovení % full/empty v míchankách AAV9 do 5 % CV.

3) Detekce agregace a složek:

• DLS odhalil rozdíly v agregaci mezi AAV2 a AAV9 po 2 týdnech při 4 °C.
• Buffer screening: zvýšená agregace při pH 4 vs. pH 7 po 25 min/45 °C.

Přínosy a praktické využití metody

• Bleskové získání komplexních dat (titr, % full/empty, agregace) z 2 µl vzorku.
• Bez nutnosti protilátek, standardů či značek.
• Vysoká propustnost (96 vzorků/h) a kompatibilita s automatizací.
• Vhodné pro vývoj, QC v GMP prostředí a výzkumná pracoviště.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do plně automatizovaných výrobních linek a 21 CFR Part 11-systémů.
• Rozšíření na další virové vektory (lentiviry, adenoviry).
• Reálné‐časové monitorování stability a formulací.
• Multiparametrické QC protokoly pro výrobu genových terapií.

Závěr

Stunner představuje inovativní platformu zkracující dobu analýzy AAV vektorů na několik minut a šetřící cenný vzorek. Díky kombinaci UV/Vis, SLS a DLS nabízí přesné stanovení titrů, prázdnost/plnost kapsid i úroveň agregace bez dodatečných reagentů, což zefektivňuje vývoj a kontrolu kvality genových terapií.

Reference

1. Dobnik D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 2019;10:1570.
2. Sommer J.M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 2003;7(1):122–8.
3. Rodrigues G., et al. Pharmaceutical Development of AAV-Based Gene Therapy Products for the Eye. Pharmaceutical Research. 2019;36:29.