Epic Gene Therapy Tools

Význam tématu

Moderní analytika genové terapie a nanopartiklových systémů vyžaduje integrované přístupy, které dokážou z malého objemu vzorku rychle poskytnout informace o koncentraci, velikosti, struktuře i stabilitě. Nástroje jako Stunner, Big Tuna a Uncle představují komplexní řešení pro charakterizaci AAV, LNP a dalších nanočástic bez potřeby barvení, standardů nebo složitého předzpracování.

Cíle a přehled článku

Článek představuje rodinu přístrojů od Unchained Labs, určených pro:

• kvantifikaci celkového titru a poměru prázdných/naplněných kapsid AAV
• měření RNA v LNP a jiné nanopartikly pomocí UV/Vis
• vysokopropustné stanovení velikosti a polydisperzity nanopartikel DLS
• automatizovanou výměnu pufru a koncentraci vzorků
• hodnocení stability kapsid a genové ejekce metodou fluorescence a SLS

Použitá metodika a instrumentace

Pro komplexní charakterizaci nanočástic a vektorů genové terapie byly využity:

• Stunner – kombinuje UV/Vis spektroskopii, dynamické a statické rozptylování světla pro určení koncentrace proteinu, ssDNA/RNA, velikosti a agregace z 2 µl vzorku.
• Big Tuna – automatizované zařízení pro ultrafiltrační diafiltraci v režimu 24 nebo 96 jamek, pro výměnu pufru a koncentraci vzorků (AAV, LNP, VLP, proteiny).
• Uncle – instrument pro termickou analýzu stability AAV, sleduje fluorescenční ejekci DNA (SYBR Gold), proteiny a agregaci pomocí SLS a DLS.

Hlavní výsledky a diskuse

Stunner umožňuje z jediného malé vzorku získat:

• celkový a plný kapsid titr AAV až do 1×10¹² vg/ml
• poměr plných a prázdných kapsid, volné proteinové a DNA komponenty
• kvantifikaci RNA v LNP rozlišením signálu terče od turbidity a pufru
• vysokopropustní měření velikosti a PDI hmotnostně malého objemu.

Big Tuna zkracuje přípravu vzorků na 30 minut a umožňuje paralelní výměnu pufru a koncentraci až 96 vzorků. Uncle odhaluje stabilitu kapsid pomocí dvoufázové kinetiky termického popu a ejekce genomu a detekce agregace, přičemž vyžaduje jen 9 µl vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

Integrace více fyzikálně-chemických metod šetří vzorky, čas i náklady:

• Bezdye, bez značení a bez nutnosti referenčních křivek
• Automatizace přípravy vzorků zvyšuje reproducibilitu a propustnost
• Možnost práce s turbidními a zakalenými roztoky nanopartikel
• Komplexní stabilitní profil AAV pro vývoj a kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Spojení spektroskopie a rozptylu světla bude dál umožňovat:

• miniaturizaci a vyšší paralelnost v charakterizaci biologických vektorů
• rozšíření metod na jiné nanoterapeutické platformy
• využití pokročilých datových algoritmů pro rychlou dekonvoluci spekter
• integrované systémy pro on-line monitoring bioprodukce.

Závěr

Nabídka přístrojů Unchained Labs představuje ucelený workflow od přípravy vzorků až po kvantitativní a kvalitativní analýzu genových vektorů a nanočástic. Díky kombinaci UV/Vis, DLS, SLS a termofluorescenční analýzy lze dosáhnout vysoké citlivosti, rychlosti a spolehlivosti dat ve výzkumu i v produkci.