Explore AAV buffers and stability with Big Tuna and Uncle

Význam tématu

Vývoj adeno-asociovaných virových (AAV) vektorů pro genovou terapii vyžaduje detailní pochopení jejich stability ve změněných podmínkách. Kyseliny, soli, pH a iontová síla extrémně ovlivňují integritu kapsid, agregaci a biologickou aktivitu AAV. Konvenční metody výměny pufru a stabilitní testování jsou časově náročné, vyžadují velké objemy vzorku a často postrádají dostatečnou propustnost pro screening většího počtu formulací.

Cíle a přehled studie

Cílem předloženého praktického postupu bylo zkombinovat vysokopropustnou automatizovanou výměnu pufru pomocí systému Big Tuna s multimodální analýzou stability na platformě Uncle. Modelovým systémem byl AAV9 vektor exprese GFP. Studie sledovala:

• Výměnu a koncentraci AAV9 z PBS do pěti různých pufrů.
• Hodnocení integrity kapsid, genomové ejekce a agregace při termálním rampování.

Použitá instrumentace

Systém Big Tuna umožnil tlakem řízenou ultrafiltraci/diafiltraci v 96jamkovém formátu nízkými objemy (≥100 µl) s cílovou výměnou 96 % a 2× koncentrací vzorků. Platforma Uncle nabídla tři detekční módy: plnospektrální fluorescence, statické rozptylování světla (SLS) a dynamické rozptylování světla (DLS). Analýza probíhala při rampě 15–95 °C rychlostí 0,4 °C/min s 9 µl na měření.

Hlavní výsledky a diskuse

Po výměně pufrů a 2× koncentraci vykázal PBS kontrolní vzorek a tři z pěti testovaných pufrů záchovu titru 96–101 %. Citrát-fosfátový pufr pH 4,0 vedl k výraznému poklesu obnovy na 71 % a tvorbě agregátů pozorovaných DLS (špička ~120 nm). Kapsidní Tm se ve čtyřech pufrech pohybovalo mezi 76–77 °C, zatímco ve vysoce kyselém pufru kleslo na 71,7 °C. Genomová ejekce vykázala posun o 11,9 °C mezi PBS a citrátovým pufrem, přičemž agregace se v kyselém prostředí spustila již při 43,5 °C v souladu se SLS daty.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysokopropustné testování až 96 formulací se záchovou malých objemů vzorku.
• Automatizovaná a replikovatelná výměna pufru a koncentrace.
• Integrované multimodální sledování stability virových částic v jednom běhu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je rozšíření na různé serotypy AAV a inkluze buněčných funkčních assay pro komplexnější charakterizaci. Využití strojového učení pro analýzu stability a optimalizaci pufrování a adaptace metody na průmyslovou výrobní škálu otevře nové možnosti ve vývoji genové terapie.

Závěr

Synergie automatizované výměny pufrů Big Tuna a komplexního vyhodnocení stability na Uncle výrazně urychluje proces vývoje AAV vektorů. Metoda minimalizuje požadavky na vzorky, zvyšuje propustnost a poskytuje ucelený přehled o kapsidní integritě, agregaci a termální stabilitě.

Reference

1. Hsu H, et al. Structural characterization of a novel human adeno-associated virus capsid with neurotropic properties. Nature Communications. 2020;11(1):3279.
2. Bernaud J, et al. Characterization of AAV vector particle stability at the single capsid level. Journal of Biological Physics. 2018;44(2):181–94.
3. Potter M, et al. A simplified purification protocol for recombinant adeno-associated virus vectors. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 2014;1:14034.
4. Brument N, et al. A versatile and scalable two-step ion-exchange chromatography process for the purification of recombinant adeno-associated virus serotypes-2 and -5. Molecular Therapy. 2002;6(5):678–86.
5. G Healthcare. Affinity Chromatography Handbook Vol. 3: Specific Groups of Biomolecules. 1962.