Snag spot-on adenovirus titer & characterization with Stunner

Význam tématu

Adenovirové vektory představují flexibilní nástroj pro vakcíny, doručení terapeutických genů a onkolytickou léčbu nádorů. Rychlá a spolehlivá kvantifikace celkového titru kapsid a poměru prázdných/plných částic je klíčová pro kontrolu kvality a optimalizaci výrobních procesů. Tradiční metody často vyžadují dlouhé přípravné kroky, drahá činidla a poskytují pouze jeden typ dat.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem textu je představit platformu Stunner a její aplikaci Adeno Quant, která kombinuje UV/Vis spektroskopii, dynamické a statické rozptylování světla pro rychlé a přesné stanovení:

• celkového titru kapsid (vg/mL),
• titru plných kapsid,
• poměru prázdných a plných částic,
• obsahu proteinu a dsDNA,
• velikosti a agregace částic.

Použitá metodika a instrumentace

Stunner kombinuje tři techniky v jediné platformě: UV/Vis spektroskopii, dynamické rozptylování světla (DLS) a statické rozptylování světla (SLS). Uživatelská aplikace Adeno Quant provádí:

• měření kompletní UV/Vis spektrální absorbance a matematickou korekci na zákal,
• rozdělení absorbance na přínos dsDNA, proteinu a rozptylu,
• 4x5s DLS akvizice pro určení velikosti a distribuce částic,
• SLS intenzitu pro stanovení koncentrace částic,
• automatické výpočty molárních extinkčních koeficientů dle sekvencí,
• zpracování dat bez nutnosti štítkování, standardních křivek či speciálních činidel.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie zahrnovala tři šarže CsCl-purifikovaných Adenovirus 5 z různých dodavatelů. Klíčové poznatky:

• Vendor 1: vysoká čistota a konzistentní titry (4,2×10¹² cp/mL celkem, 3,4×10¹² vg/mL plných, 81 % plných kapsid), nízká agregace a nízký podíl volných proteinů nebo DNA.
• Vendor 2: monodisperzní velikost částic (Z-avg 122,6 nm, PDI <0,1), avšak zvýšený obsah volné dsDNA naznačující možnou kontaminaci hostitelskou DNA.
• Vendor 3: správné množství celkového proteinu a DNA, ale významná agregace, která poukazuje na nestabilitu vzorku.

Matematická korekce zákalu a kombinace UV/Vis s DLS/SLS činí výsledky odolné vůči rušení způsobenému absorpčními složkami nebo zbytkovými nečistotami.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma Stunner umožňuje:

• rychlé měření až 96 vzorků za hodinu bez složité přípravy,
• minimální objem vzorku (2 µL),
• komplexní charakterizaci v jediné analýze,
• snadnou automatizaci a 21 CFR Part 11 kompatibilitu,
• využití dat jako KPI nebo CQA pro kontrolu výrobního procesu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat integraci s online průtokovými systémy pro kontinuální monitoring výrobních linek, rozšíření aplikace na jiné virové vektory nebo nanopartikule a implementaci pokročilých algoritmů strojového učení pro prediktivní hodnocení stability vzorků.

Závěr

Stunner s aplikací Adeno Quant poskytuje rychlou, komplexní a přesnou metodu pro stanovení titru adenovirových kapsid a poměru prázdné/plné částice. Díky kombinaci UV/Vis, DLS a SLS nahrazuje časově náročné a variabilní standardní techniky, což zkracuje dobu analýzy a zvyšuje spolehlivost dat pro výzkum i průmyslovou výrobu.

Reference

1. Wang DL, Wang CJ, Tan CY, Hsu D, Hennessey JP Jr. A Robust Approach for the Quantitation of Viral Concentration in an Adenoviral Vector-Based HIV Vaccine by Real-Time Quantitative PCR. Human Gene Therapy. 2006;17:728–737. doi:10.1089/hum.2006.17.728
2. Sutjipto S, Ravindran S, Cornell D, et al. Characterization of Empty Capsids from a Conditionally Replicating Adenovirus for Gene Therapy. Human Gene Therapy. 2005;16:109–125. doi:10.1089/hum.2005.16.109
3. Maizel JV III, White DO, Scharff MD. The Polypeptides of Adenovirus: Evidence for Multiple Protein Components in the Virion. Virology. 1968;36:115–125. doi:10.1016/0042-6822(68)90121-9
4. Berkowitz SA. Determining the Concentration and the Absorptivity Factor at 260 nm in SDS of the Adenovirus Reference Material Using Analytical Ultracentrifugation. Analytical Biochemistry. 2008;380:152–154. doi:10.1016/j.ab.2008.05.014
5. Sweeney JA, Hennessey JP. Evaluation of Accuracy and Precision of Adenovirus Absorptivity at 260 nm Under Conditions of Complete DNA Disruption. Virology. 2002;295:284–288. doi:10.1006/viro.2002.1406
6. Heider S, Metzner C. Quantitative Real-Time Single Particle Analysis of Virions. Virology. 2014;462–463:199–206. doi:10.1016/j.virol.2014.06.005
7. Vellinga J, Smith JP, Lipiec A, et al. Challenges in Manufacturing Adenoviral Vectors for Global Vaccine Product Deployment. Human Gene Therapy. 2014;25:318–327. doi:10.1089/hum.2014.007
8. Pinteric L, Taylor J. The Lowered Drop Method for the Preparation of Specimens of Partially Purified Virus Lysates for Quantitative Electron Micrographic Analysis. Virology. 1962;18:359–371. doi:10.1016/0042-6822(62)90027-2
9. Shabram PW, Giroux DD, Goudreau AM, et al. Analytical Anion-Exchange HPLC of Recombinant Type-5 Adenoviral Particles. Human Gene Therapy. 1997;8:453–465. doi:10.1089/hum.1997.8.4-453