Coupling ion exchange chromatography with mass spectrometry to characterize charge heterogeneity of mAbs under near-native conditions using a ProPac 3R SCX column

Význam tématu

Analýza heterogenity náboje u terapeutických monoklonálních protilátek je klíčovým kritickým atributem kvality. Vysoká rozlišovací schopnost chromatografické separace variant společně s detailní charakterizací pomocí hmotnostní spektrometrie umožňuje sledovat modifikace, jako je deamidace, oxidace či změny glykanačního profilu, v podmínkách blízkých rodným strukturám proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat metodu silně kationtové výměnné chromatografie (SCX) s pH gradientem kompatibilním s MS a demonstrovat její výkon při analýze charge variant durvalumabu. Dále byly provedeny testy reprodukovatelnosti mezi šaržemi SCX kolony a studium vlivu tepelných stresových podmínek na profil nábojových variant.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Flex (pumpy, sampler, kolonnový ohřívač, detektor UV/VIS)
• pH metr Thermo Scientific Orion Star A211
• ProPac 3R SCX kolona, 2 × 50 mm, 3 μm polymerní částice
• Hmotnostní spektrometr Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap
• Software Chromeleon CDS 7.2.10 a BioPharma Finder 5.1

Metodika

Pro separaci byl připraven pH gradient z 25 mM uhličitanu amonného/30 mM octové kyseliny (pH 5,3) jako mobilní fáze A a 10 mM hydroxidu amonného (pH 10,2) jako mobilní fáze B. Optimalizovány byly tři gradienty, přičemž nejlepší rozlišení variant bylo dosaženo elucí z 15 % B na 75 % B v průběhu 28 minut. Durvalumab byl testován ve formě 1 mg/mL, dále vystaven tepelnému stresu při 50 °C po dobu až 7 dnů. Analýza MS probíhala v režimu Full MS, rozlišení 35 000 při m/z 200, scan 2 500–8 000 Da.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda SCX–MS umožnila vysoce rozlišit následující skupiny variant: pět kyselých, jeden hlavní a tři bazické špičky. Reprodukovatelnost mezi dvěma výrobními šaržemi SCX kolony byla v rozsahu %RSD 0,17–4,75. Při tepelném stresu se procentuální podíl kyselých špiček zvýšil až o 100 % a bazické špičky se snížily, kromě mírného nárůstu špičky Basic 1 odpovídající oxidaci. Vysoké rozlišení MS dekonvoluce potvrdilo přítomnost modifikací jako deamidace, oxidace a změny glykanačních forem (A2G0F, A2G1F apod.), s chybami měření < 6 ppm.

Přínosy a praktické využití metody

Online spojení SCX s Orbitrap MS poskytuje rychlý a citlivý přístup k charakterizaci charge variant mAbs. Metodu lze snadno přizpůsobit různým terapeutickým protilátkám (např. rituximab, trastuzumab) a využít ji pro QC laboratoře i vývojovou fázi biopharma projektů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zlepšení materiálů stacionární fáze pro vyšší účinnost separace
• Automatizace přípravy pH gradientu a integrace s AI nástroji pro rychlejší vývoj metod
• Rozšíření na další posttranslační modifikace a kompletní top-down proteomiku
• Nasazení ve stage-gate studiích biosimilars a personalizované medicíně

Závěr

Vyvinutá SCX–MS metoda s MS-kompatibilním pH gradientem na ProPac 3R SCX koloně nabízí vysokou rozlišovací schopnost, robustní reprodukovatelnost a detailní mapování nábojové heterogenity mAbs. Tepelný stres vedl ke zvýšení kyselých variant a detekci nových modifikací. Metoda představuje efektivní nástroj pro biopharmaceutický výzkum a kontrolu kvality.

Reference

1. Wu G, Yu C, Wang W, Du J, Fu Z, Xu G, Li M, Wang L Anal Chem 2023, 95, 2548–2560
2. Liu AP, Yan Y, Wang S, Li N Anal Chem 2022, 94, 6355–6362