3μm monodisperse particles for Ion Exchange Chromatography stationary phases and their impact on the separation of biomolecules

Význam tématu

Monodisperzní částice se vyznačují velmi úzkou distribucí velikostí, což umožňuje vytvořit chromatografické fáze s vysokou efektivitou, reprodukovatelností a rozlišením. To je klíčové pro analýzu proteinů a jejich variant v biotechnologii, kde je často potřebné odlišit drobné změny v kyselých a zásaditých formách molekul a zabezpečit spolehlivou kvantifikaci v komplexních vzorcích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo zhodnotit 3µm monodisperzní částice jako platformu pro iontovou výměnu (IEX) včetně slabě a silně kationtových (WCX/SCX) a silně aniontových (SAX) fází. Srovnávaly se s běžně používanými polydisperzními částicemi velikosti 5–10µm a testovalo se na různých modelech proteinů (cytochrom C, ribonukleáza A, NISTmAb, protein G) pomocí solných a pH gradientů, včetně MS kompatibilních volatile bufferů.

Použitá metodika

• Příprava WCX fází radikálovou polymerizací a SCX/SAX fází pomocí ATRP technologie.
• Nanesení konformní hydrofilní vrstvy s etoxy-hydroxylovými skupinami pro potlačení hydrofobních interakcí.
• Chromatografie v režimu izokratickém, solný a pH gradient (volatilní a nevolatilní bufferové systémy).
• Testování replikovatelnosti s částicemi v rozsahu 2,8–3,2µm.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex (Quaternary Pump, Column Compartment, Split Sampler FT, VWD) se Semi-Micro Bio Flow Cell.
• Kolony prototype monodisperzní WCX 3µm a 5µm, Thermo Scientific ProPac 3R SCX 3µm a ProPac 3R SAX 3µm.
• Software Dionex Chromeleon 7 pro zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• 5µm monodisperzní částice vykázaly o 72 % vyšší efektivitu než polydisperzní 5µm a 3µm verzí přinesly další nárůst o 92 % oproti 5µm.
• 3µm monodisperzní SCX fáze zlepšila rozlišení kromějších variant NISTmAb v kratší kolonce (4×100 mm) ve srovnání s 10µm kolonkou (4×250 mm).
• Reprodukovatelné retence a rozlišení proteinů napříč částicemi 2,8–3,2µm indikují vysokou konzistenci výroby.
• SAX fáze umožnila efektivní separaci Protein G a IdeS-digestion fragmentů (Fc/2 a F(ab')2) v solných i volatile pH gradientech.
• Volatilní pH gradienty umožňují přímou MS detekci nativních variant pro detailní charakterizaci proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká efektivita a kratší doba analýzy zvyšují laboratorní throughput.
• Lepší citlivost a rozlišení proteinových variant v biopharma QC a R&D.
• Možnost kombinace s on-line MS pro detailní profilování post-translačních modifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace povrchových chemických vrstev pro specifické proteiny.
• Rozšířená nabídka monodisperzních částic pro jiné modality chromatografie.
• Integrace s hyphenovanými technikami (LC-MS/MS, native MS).
• Vývoj miniaturizovaných a vysokopropustných systémů pro bioprocesní kontroly.

Závěr

Monodisperzní částice 3µm představují významný pokrok v iontové výměně proteinů, nabízejí vynikající efektivitu, rozlišení a reprodukovatelnost. Kombinace WCX, SCX a SAX fází s volatile pH gradienty otevírá nové možnosti pro masovou spektra­lní analýzu nativních proteinových variant.

Reference

• Rivera B, Anspach JA, Rao S. LCGC Supplements. 2018;36(6):24-29.