Monitoring of multiple quality attributes of intact monoclonal antibodies from bioreactors by switchable 2D-LC-MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují významnou třídu bioterapeutik s vysokou mírou mikroheterogenity, která vyplývá z posttranslačních modifikací a agregace. Kontinuální monitoring kvality během bioprodukce je klíčový pro zajištění konzistence účinnosti, bezpečnosti a stability produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na vývoj přepínatelného dvoudimenzionálního LC-MS systému (2D-LC-MS) pro simultánní stanovení titeru monoklonálních protilátek, analýzu nabíjecích variant, glykovaných forem a agregátů přímo z odebraných vzorků buněčné kultury CHO buňkami po dobu 10 dnů.

Použitá metodika a instrumentace

• Vanquish Flex Simple Switch 2D-LC systém s ventily pro heart-cut transfer frakcí mezi dimenzemi.
• První dimenze: protein A afinitní kolona (MAbPac Protein A) pro čištění a stanovení titeru.
• Druhá dimenze: SCX kolona (ProPac 3R) pro oddělení nabíjecích variant pH gradientem a trap/elute mod pro přechod na SEC kolonu (MAbPac SEC-1) pro stanovení velikostních variant.
• Detekce: Orbitrap Exploris MX HRAM MS s BioPharma modulem, řízení Chromeleon CDS, dekonvoluce v BioPharma Finder.
• Využití těkavých pufrů kompatibilních s MS (ammonium acetate, pH gradienty, soli pro eluce).

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární kalibrace titeru až do 20 µg mAb s R2=0,999, citlivé stanovení postupného nárůstu titeru z 7 na 52 µg/mL během 10 dnů.
• Identifikace a kvantifikace čtyř hlavních glykovaných forem (G0F_G0F, G0F_G1F, G1F_G1F/G0F_G2F, G1F_G2F) a sledování jejich poměru v čase.
• Detekce několika neznámých nabíjecích variant s masovými posuny +98 Da, +177 Da, -58 Da a -116 Da; částečné přiřazení k modifikacím, jako glycinová ztráta a amidace.
• Analýza agregace protilátky prokázala nízkou hladinu HMW frakcí (<0,01 %) v raných dnech, postupný vzestup až na 0,12 % k závěru produkčního procesu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá víceatributová metoda (iMAM) umožňuje v krátkém čase získat informace o titru, nabíjecích variantách, glykovaných formách a agregaci.
• Přímé napojení na MS bez nutnosti přepínání chromatografických metod zvyšuje efektivitu a minimalizuje manipulaci se vzorkem.
• Vysoká reproducibilita retence a kvantitativních výsledků vhodná pro procesní kontrolu i QA/QC laboratoře.
• Možnost aplikace v reálném čase pro optimalizaci bioprodukce a zajištění konzistence bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Postupný vývoj metod iMAM bude směřovat k integraci automatizace a umělé inteligence pro prediktivní kontrolu bioprocesu. Další rozšíření lze očekávat pro různé formáty biologik, hlubší charakterizaci proteoform na úrovni peptidů či glykokonjugátů a nasazení v online monitoringu průmyslové produkce.

Závěr

Studie demonstrovala efektivní přepínatelný 2D-LC-MS protokol pro detailní online sledování kvality monoklonálních protilátek během bioprodukce. Metoda nabízí komplexní, rychlou a spolehlivou analýzu hlavních kvality definujících atributů přímo z bioreaktorových vzorků.

Reference

• 1. Dai J., Ji C. In-depth size and charge variants characterization of monoclonal antibody with native mass spectrometry. Anal. Chim. Acta 2023, 1265.
• 2. Füssl F., Millán-Martín S., Bones J., Carillo S. Cation exchange chromatography on a monodisperse 3 µm particle enables extensive analytical similarity assessment of biosimilars. J. Pharm. Biomed. Anal. 2023, 234.
• 3. Carillo S., Criscuolo A., Füssl F., Cook K., Bones J. Intact multi-attribute method (iMAM): A flexible tool for the analysis of monoclonal antibodies. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2022, 177.
• 4. NISTCHO; National Institute of Standards and Technology. RGTM 10197 cNISTmAb reference.
• 5. Jakes C., Füssl F., Zaborowska I., Bones J. Rapid analysis of biotherapeutics using Protein A chromatography coupled to Orbitrap mass spectrometry. Anal. Chem. 2021, 93(40).
• 6. Moussa A., et al. Numerical and experimental investigation of analyte breakthrough from sampling loops used for multi-dimensional liquid chromatography. J. Chromatogr. A 2020, 1626.
• 7. Chen C.-H., et al. Intact NIST monoclonal antibody characterization—Proteoforms, glycoforms—Using CE-MS and CE-LIF. Cogent Chem. 2018, 4(1).
• 8. Füssl F., Trappe A., Cook K., Scheffler K., Fitzgerald O., Bones J. Comprehensive characterisation of the heterogeneity of adalimumab via charge variant analysis hyphenated on-line to native high resolution Orbitrap mass spectrometry. mAbs 2019, 11(1).
• 9. Böttinger K., et al. Small is beautiful – examining reliable determination of low abundant therapeutic antibody glycovariants. J. Pharm. Anal. 2024.