Salt gradient analysis of Protein G using a 3 μm monodisperse SAX chromatography column

Význam tématu

Analýza nabitých variant proteinů je klíčovou součástí vývoje a kontroly kvality bílkovinných terapeutik. Ion­tovýměnná chromatografie umožňuje detekci a rozlišení různých post­translačních modifikací a variant, které ovlivňují účinnost, stabilitu i bezpečnost biologických léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat vývoj a optimalizaci metodion­tové výměnné chromatografie pro Protein G pomocí 3 µm monodisperzního silně aniontového (SAX) ProPac 3R SAX slotu (4 × 100 mm). Studie zahrnuje:

• vývoj rychlé QC metody
• vysoce rozlišující analytické metody
• posouzení reprodukovatelnosti lot-to-lot
• srovnání s předchozími polydisperzními SAX fázemi

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci Protein G (pI~4,5) byl použit systém Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC s UV detekcí při 280 nm a softwarem Chromeleon 7.2.10. Mobilní fáze tvořil 20 mM Tris buffer (pH 8,0) a 20 mM Tris + 500 mM NaCl. Parametry metod byly optimalizovány v následujícím pořadí významu:

• pH bufferu (7,5–8,5)
• počáteční koncentrace soli (60–80 mM NaCl)
• strmost gradientu (10–30 min)
• průtočné rychlosti (0,3–0,5 mL/min)
• teploty kolony (30–60 °C)
• množství vzorku (1–50 µg)

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace pH ukázala, že pH 8,0 poskytuje nejlepší rozlišení blízkých kyselých a bazických variant. Počáteční nasycení 60 mM NaCl zabránilo izokratickému eluci během naložení. Delší gradienty (20–30 min) přinesly vyšší rozlišení, zatímco rychlý 6minutový gradient umožnil QC analýzu s dostatečnou separací. Nižší průtočné rychlosti zvyšují citlivost při nižších tlakových nárocích. Teplota 30 °C byla doporučena jako kompromis mezi stabilitou vzorku a tlakem. Dynamická kapacita kolony byla definována dosažením dvojnásobku šířky vrcholu hlavní bílkoviny (~10 µg). Kolona vykázala velmi nízké carryover (~0,06 %) i při 50 µg naložení. Lot-to-lot studie potvrdily vysokou reprodukovatelnost separací. Tepelně stresovaný Protein G (40 °C/72 h) odhalil nárůst kyselých a bazických variant, které bylo možné detailně kvantifikovat. Ve srovnání se staršími ProPac SAX-10 fázemi prokázal ProPac 3R SAX výrazně lepší rozlišení a užší vrcholy i při kratší koloně.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• vysoké rozlišení a citlivost pro QC i výzkum
• snadný přenos mezi laboratořemi díky robustní monodisperzní technologii
• nízkou variabilitu mezi výrobními šaržemi
• rychlou i hloubkovou analýzu dle potřeb

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení pro komplexní biologika, integrace s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci variant, automatizace metodiky a využití strojového učení k optimalizaci chromatografických podmínek. Vývoj monodisperzních materiálů a adaptace na high-throughput formáty podpoří rychlejší screening biologických vzorků.

Závěr

Monodisperzní ProPac 3R SAX 3 µm kolona přináší vysoce reprodukovatelné, robustní a vysoce rozlišující separace nabitých variant proteinů. Flexibilní nastavení parametrů metod umožňuje uspokojit jak požadavky rychlého QC, tak detailních výzkumných protokolů.

Reference

• Rivera B.; Anspach J.A.; Rao S. LCGC Supplements, 2018, 36(6), 24–29.
• Taha M.; e Silva F.; Quental M.; Ventura S.M.; Freire M.; Coutinho J.P. Green Chemistry, 2014, 16(6), 3149–3159.