Analysis of Oligonucleotides Using an Ion-Pairing-Free Reversed-Phase Method with TOF LC/MS

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů je klíčová v biotechnologickém a farmaceutickém výzkumu při vývoji terapeutik založených na krátkých nukleových kyselinách. Tradiční iontově párové metody jsou nákladné, zatěžují životní prostředí a vyžadují speciální údržbu, což omezuje jejich každodenní využití v kvalitativní a kvantitativní analýze.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout reverzní fázovou chromatografii bez použití iontově párovacích činidel spojenou s časově-of-flight hmotnostní spektrometrií (TOF LC/MS). Metoda byla ověřena na více než třinácti typech oligonukleotidů včetně modifikovaných antisense, siRNA, DNA a sgRNA až do délky 103 nukleotidů.

Použitá metodika a instrumentace

Laboratorní konfigurace zahrnovala Agilent 6230B TOF LC/MS s AJS ESI zdrojem a softwarem MassHunter Acquisition v11 a BioConfirm v12.1. Chromatografie probíhala na AdvanceBio Oligonucleotide kolóně (2.1×50 mm, 2.7 μm) při 75 °C a průtoku 0.8 mL/min. Mobilní fáze A tvořila 20 mM amonného hydrogenuhličitanu ve vodě, fáze B methanol. Gradientní program šel z 10 % B na 50 % B za 5 min a následně na 90 % B. Vzorky o koncentraci 1–10 µM byly uchovávány při 8 °C v autosampleru.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání mobilních fází ukázalo nejlepší ionizaci s amonným hydrogenuhličitanem ve srovnání s acetátem a formiátem. Chromatografická separace 14-, 17-, 20- a 21-mer RNA dosáhla průměrného rozlišení R=1.47 s možností zvýšení na R=1.5 pro sledování n–1 nečistot. Hmotnostní přesnost byla v průměru lepší než 8.6 ppm, nejhorší odchylka dosáhla 12.5 ppm. Repetitivní analýza ASO-2 (55 injekcí) vykázala RSD retence 0.72 % a RSD ploch 1.74 %, což dokládá stabilitu metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění potřeby iontově párovacích činidel snižuje náklady a ekologickou zátěž
• Vysoká přesnost měřených hmotností a vynikající opakovatelnost
• Široká škála aplikací na různé typy oligonukleotidů
• Vhodné pro QC laboratoře i výzkumné aplikace

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace metody do plně automatizovaných QC linek, rozšíření na delší a komplexnější sekvence a kombinace s vysoce výkonnou UHPLC. Dále se předpokládá využití v multiomics studiích, při monitorování stability terapeutik a vývoji nových kolon s vylepšenou selektivitou.

Závěr

Navržená RP LC/MS bez iontově párovacích činidel představuje efektivní, udržitelnou a robustní alternativu k tradičním metodám. Metoda prokázala univerzálnost, vysokou přesnost a opakovatelnost v analýze různorodých oligonukleotidů, což ji činí atraktivní pro výzkum i rutinní kontrolu kvality.

Reference

1. Hayashi Y, Sun Y Overcoming Challenges in Oligonucleotide Therapeutics Analysis A Novel Nonion Pair Approach J Am Soc Mass Spec 2024 35 9 DOI 10.1021/jasms.4c00270