Oligonucleotide Characterization by Agilent 1290 Infinity II Bio LC and 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidové terapie představují moderní přístup k léčbě řady onemocnění, přičemž klíčovými atributy jsou identita, čistota, přítomnost nežádoucích přídatků a přesné složení sekvence. Robustní analytické metody zajišťují kvalitu, bezpečnost a efektivitu konečných produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo využít integrované workflow Target Plus Impurities (TPI) a Sequence Confirmation (SC) v softwaru Agilent MassHunter BioConfirm 12.0 ve spojení s Agilent 1290 Infinity II Bio LC a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF k potvrzení identity, kvantifikaci přídatků a ověření sekvence dvou oligonukleotidových vzorků (18mer ASO a 28mer aptamer).

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém: Agilent 1290 Infinity II Bio LC se dvěma vysokorychlostními pumpami, multisamplerem s chlazením, multikolónovým termostatem a DAD detektorem.
• Kolóna: AdvanceBio Oligonucleotide 2.1 × 50 mm, 2.7 µm při 65 °C, termostat 4 °C.
• Mobilní fáze: A 15 mM TEA + 400 mM HFIP ve vodě, B metanol; průběhy gradientů pro TPI (10 min) a SC (5 min).
• MS detektor: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Agilent Jet Stream v negativním režimu, rozsah 300–3 200 m/z (TPI), cílený MS/MS 100–3 000 m/z (SC), HiRes 4 GHz.
• Sofware: MassHunter Acquisition 11.0 pro sběr dat, BioConfirm 12.0 pro zpracování.
• Vzorky: 18mer ASO a 28mer aptamer s modifikacemi (2′-methoxy, fluoro, fosforotioátové vazby).

Hlavní výsledky a diskuse

• TPI workflow: Optimální chromatografické rozlišení ASO a vedlejších produktů s 10min gradientem a 0,5 mL/min. Dekonvoluce s Max Entropy dosáhla hmotnostní přesnosti pod ±1 ppm a detekce truncátů a elongátů v rozsahu 5–8 kDa.
• Relativní kvantifikace: Metoda Find-by-Formula pro 17 cílených 5′-truncátů prokázala reprodukovatelnost RSD < 5 % a detekci nízkých hladin (~0,4 %).
• Sequence Confirmation: 5min LC gradient a cílená MS/MS analýza (-7 nabití pro ASO, -10 pro aptamer) umožnily 100 % sekvenční pokrytí z jediného vstřiku, díky optimalizovanému CE a agregaci MS/MS dat podle nabití.

Přínosy a praktické využití metody

Integrované workflow v BioConfirm 12.0 zkracuje čas nutný k potvrzení identity, vyhodnocení přídatků a ověření sekvence oligonukleotidů. Metoda vyžaduje malé vzorky, nabízí vysokou reprodukovatelnost a lze ji snadno zařadit do QC i R&D laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na dlouhé a chemicky modifikované oligonukleotidy (siRNA, gRNA).
• Automatizace datové analýzy a integrace s bioinformatickými nástroji.
• Real-time monitoring syntézy a stability produktů.
• Miniaturizace a implementace do high-throughput platforem.

Závěr

Společné použití Agilent 1290 Infinity II Bio LC a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s BioConfirm 12.0 workflows poskytuje rychlou, přesnou a vysoce reprodukovatelnou platformu pro komplexní charakterizaci syntetických oligonukleotidů. Tato řešení podporují efektivní vývoj i rutinní kontrolu kvality léčiv.

Reference

• Wong D.; Rye P. An Integrated Workflow for the Analysis of Oligonucleotides and Their Impurities by Agilent High-Resolution LC/(Q-TOF) Mass Spectrometry. Publication 5994-4817EN, 2022.
• Wong D.; Rye P. An Integrated Comprehensive and Integrated Workflow for Oligonucleotide Sequence Confirmation by Agilent High-Resolution LC/Q-TOF. Publication 5994-5071EN, 2022.
• Capaldi D. et al. Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Products. Nucleic Acid Therapeutics 2017, 27, 309–322.