Fast Track to Certainty: Confident Biopharma Decisions with LC-Single Quadrupole Mass Detection

Význam tématu

V dynamickém prostředí biotechnologických a farmaceutických laboratoří je klíčové rychle a spolehlivě vyhodnocovat strukturu a čistotu biomolekul, jako jsou monoklonální protilátky, terapeutické peptidy či syntetické oligonukleotidy. Tradiční metody založené na separaci UV detektorem často vyžadují několik paralelních analytických postupů pro potvrzení identity, stanovení čistoty a vyprofilování nečistot. Integrací LC s měřením hmotnostní spektrometrie pomocí jediného kvadrupólu, jako nabízí Agilent InfinityLab Pro iQ Plus, lze tyto kroky konsolidovat a urychlit bez nutnosti komplikovaných iontově-párovacích činidel či vysoce specifických přístrojových konfigurací.

Cíle a přehled studie

Cílem předloženého souhrnu je ukázat potenciál jednotné platformy LC/SQ-MS pro různé aplikace v oblasti bioproteomiky a syntetické chemie:

• Profilování glykozylace intactního a redukovaného trastuzumabu;
• Analýzu syntetických oligonukleotidů bez iontově-párovacích reagentů;
• Profilování vzniklých nečistot tirzepatidu při stresových podmínkách;
• Hodnocení čistoty antisens oligonukleotidové vzorky;
• Zvýšení produktivity purifikačních LC workflow za pomoci hmotnostní detekce.

Použitá metodika a instrumentace

Ve všech aplikacích byla použita LC systémy Agilent Infinity II/III spojené s jediným kvadrupólem InfinityLab Pro iQ Plus a softwarem OpenLab CDS 2.8:

• Separace pomocí bio a preparativních C18 kolon (2.1×50–150 mm, 5 µm resp. 10×50 mm, 5 µm).
• Eluční gradienty s mobilními fázemi na bázi vody s formi­kovou kyselinou a aketonitrilu či methanolu; alternativou bez iontově-párovacích činidel byly roztoky amonného hydrogenuhličitanu.
• MS detekce ESI pozitivní i negativní režim, rozsah m/z až 3 000, scan time 1 000–1 500 ms.

Hlavní výsledky a diskuse

• Glykozylace trastuzumabu: S jediným kvadrupólem bylo možné identifikovat pět intactních glykoform a přesně stanovit jejich relativní zastoupení. Po redukci protilátky se zřetelně oddělily LC a HC řetězce, kde se objevily glykoformy G0, G0F, G1F, G2F s chybou měřené hmotnosti v jednotkách ppm.
• Analýza oligonukleotidů: Namísto toxických HFIP–alkylaminových metod byl ověřen eluce v gradientu amonného hydrogenuhličitanu/methanolu, která poskytla dostatečnou retenci i citlivost pro ASO a siRNA. Otevřená dekonvoluce v OpenLab CDS umožnila rychlé potvrzení molekulárních hmotností s RSD < 0,1 %
• Stresové profilování tirzepatidu: Při skladování za různých pH a teplot se objevily oxidační produkty (+32 Da, +4 Da) a neznámé nečistoty. Jednotný kvadrupól citlivě detekoval degradanty pod 2 % signálu, což je dostačující pro rutinní QA/QC.
• Hodnocení čistoty ASO: Kompletní full scan v negativním režimu detekoval celou škálu n+1, n–1 produktů a aduktů s LOQ 0,2 %. Pomocí Oligo Analysis Accelerator se určila čistota ASO vzorku (UV 98 %, MS 87 %).
• Purifikační workflow: Mass-directed fraction collection zkracuje dobu frakcionace, lze definovat až čtyři prahy pro různé cílové ionty a vyloučit koelutující nečistoty pomocí NOT logiky. Každý vzorek ve frontě může mít vlastní přepsání prahů a složení cílových iontů, což maximalizuje flexibilitu.

Přínosy a praktické využití metody

• Konsolidace tří metod (identita, čistota, nečistoty) do jediné analýzy.
• Minimalizace použití toxických reagensů a provozních nákladů.
• Zvýšení důvěry ve výsledky přesnou masovou identifikací i u těžko separovatelných sloučenin.
• Flexibilní nastavení prahů a cílových iontů usnadňuje přechod mezi různými analyty.
• Robustní a uživatelsky přívětivá detekce pro rutinní QC/QA laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšiřování hmotnostního rozsahu nad m/z 3 000 pro těžké biologické léčiva a konjugáty.
• Využití umělé inteligence a strojového učení pro automatickou optimalizaci prahů a výběr aduktů.
• Integrace do multiplatformních multimodálních laboratoří pro komplexní charakterizaci biomolekul.
• Online propojení s elektronickými laboratorními informačními systémy (LIMS) pro sledování kvality výroby v reálném čase.

Závěr

Agilent InfinityLab Pro iQ Series představuje výkonné, citlivé a snadno ovladatelné řešení pro LC/MS a mass-directed fraction collection. Unifikuje analytické postupy napříč biopharma QC/QA, minimalizuje čas i náklady a přináší vysokou spolehlivost výsledků včetně detailní masové informace.

Reference

1. Pack et al. Org. Process Res. Dev. 2025, 29(1), DOI:10.1021/acs.oprd.4c00386.
2. Higel et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2016, 100, 94–100.
3. Hayashi & Sun. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2024, 35(9), 2034–2037.
4. Badgujar et al. J. Pept. Sci. 2025, 31, e3652.
5. Rentel et al. Nucleic Acid Ther. 2022, 32(3), 206–220.