Analysis of Oligonucleotides Using Ion-Pairing Alternatives on the Agilent Pro iQ Plus

Význam tématu

Oligonukleotidy představují moderní terapeutickou třídu zaměřenou na modulaci exprese genů prostřednictvím cíleného tlumení nebo degradace mRNA. Jejich přesná molekulární charakterizace, zejména ověření molekulové hmotnosti, je klíčová pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti syntetických sekvencí. Tradiční metody využívající iontově-párové činidla (alkylaminy) a perfluorované alkoholy požadují specializovanou přístrojovou výbavu, toxické a nákladné reagencie a častou údržbu.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo ověřit praktickou použitelnost reverzní fázové LC/MS metody bez iontově-párových činidel pro středně až vysoce průtokové analýzy oligonukleotidů. Metoda využívá mobilní fázi na bázi amonného hydrogenuhličitanu (NH4HCO3) a methanolu a kombinuje chromatografickou retenci s dostatečnou citlivostí ESI-MS. Práce demonstruje analýzu tří antisense oligonukleotidů (ASO-1, ASO-2, Fomivirsen) a jednoho siRNA duplexu (Givosiran) s opakovatelností a robustností výsledků.

Použitá instrumentace

• LC/MS systém Agilent InfinityLab Pro iQ Plus (G6170A) s AJS-ESI zdrojem
• Agilent Infinity II 1290 bio binary pump, multisampler a kolónová komora
• Agilent Infinity II 1260 diode array detector HS (G7117C)

Použitá metodika a instrumentační nastavení

Vzorky oligonukleotidů byly přípraveny v 50 µM vodném roztoku a uchovávány v chlazeném autosampleru při 8 °C. Chromatografie se prováděla na kolóně AdvanceBio oligonucleotide (2,1×50 mm, 2,7 µm) při 75 °C. Mobilní fáze A: 20 mM NH4HCO3 ve vodě; B: methanol. Gradient od 5 % do 40 % B během 3 minut, průtok 0,7 mL/min. MS parametry: pozitivní režim, m/z 700–2 800, teploty zdroje 300 °C, kapilární napětí 3 000 V, fragmentor 180 V.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda poskytla ostré píky a konzistentní retenci pro všechny testované ASO i siRNA. Deconvoluce spekter v OpenLab CDS ukázala přesné průměrné hmotnosti se středním odchylkou menší než ±1 Da a RSD <0,1 % v opakovaných injekcích. Ammonný hydrogenuhličitan podpořil nižší nabitostních stavů, čímž se minimalizovalo překrytí spekter a zvýšila jistota identifikací. U Givosiranu byla dosažena baseline separace sense a antisense řetězců úpravou gradientu (5–45 % B), fragmentor snížen na 120 V kvůli ochraně glykonjugátu.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění toxických iontově-párových činidel a perfluorovaných alkoholií
• Snížení provozních nákladů a frekvence údržby přístrojů
• Možnost středně až vysoce průtokové rutinní kontroly kvality syntetických oligonukleotidů
• Plně automatizovaná deconvoluce spekter s minimální optimalizací

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření využití neiontově párových metod v analytice velkých biomolekul, včetně vývoje LCM/MS protokolů pro mRNA vakcíny či modifikované siRNA. Integrace s vysoce výkonnými deconvolučními algoritmy a AI-řízenou optimalizací gradientů může dále zrychlit a zpřesnit rutinní analýzu oligonukleotidů.

Závěr

Studie prokázala, že použití amonného hydrogenuhličitanu v kombinaci s jednotkově hmotnostním Agilent Pro iQ Plus LC/MS je životaschopnou alternativou k tradičním iontově-párovým metodám. Přístup zajišťuje vysokou reprodukovatelnost, citlivost a jednodušší údržbu systému při zachování kvality molekulární konfirmace oligonukleotidů.

Reference

• Herkt M., Thum T. Pharmacokinetics and Proceedings in Clinical Application of Nucleic Acid Therapeutics. Mol. Ther. 2021, 29(2), 521–539.
• Watts J.K., Corey D.R. Silencing Disease Genes in the Laboratory and the Clinic. J. Pathol. 2012, 226(2), 365–379.
• Apffel A. et al. Analysis of Oligonucleotides by HPLC−Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 1997, 69(7), 1320–1325.
• Guimaraes G.J., Bartlett M.G. The Critical Role of Mobile Phase pH in Oligonucleotide Ion-Pair Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Methods. Future Sci. OA 2021, 7(10), FSO753.
• Basiri B. et al. Assessing the Interplay Between the Physicochemical Parameters of Ion-Pairing Reagents and the Analyte Sequence on the Electrospray Desorption Process for Oligonucleotides. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2017, 28(8), 1647–1656.
• Hayashi Y., Sun Y. Overcoming Challenges in Oligonucleotide Therapeutics Analysis: A Novel Nonion Pair Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2024, 35(9), 2034–2037.
• Chen B. et al. The Effect of Organic Modifiers on Electrospray Ionization Charge-State Distribution and Desorption Efficiency for Oligonucleotides. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2013, 24(2), 257–264.