MS/MS Oligonucleotide Sequencing Using LC/Q-TOF with HILIC Chromatography

Význam tématu

Analýza sekvence oligonukleotidů je zásadní pro vývoj nových léčiv, diagnostiku a kontrolu kvality v biotechnologii. Tradiční iontově párové reverzní fáze poskytují dobrou separaci, ale zanechávají rezidua činidel, která komplikují následné analýzy a prodlužují dobu přípravy systému. Metody založené na HILIC (hydrofilní interakční chromatografie) bez iontových párů s LC/Q-TOF MS nabízejí rychlejší obnovu kolony, čistší prostředí a vysokou kvalitu dat bez potřeby rozsáhlého čištění.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo demonstrovat možnost potvrzení sekvence různých typů oligonukleotidů (20- a 30-mer DNA, 21-mer RNA, aptamer a ASO) pomocí HILIC chromatografie spojené s vysokým rozlišením MS/MS na systému Agilent 6545XT LC/Q-TOF. Studie rozšiřuje předchozí práce zaměřené na MS1 charakterizaci a přidává cílenou fragmentaci v MS/MS režimu za účelem dosažení stoprocentní pokrytí sekvence.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC systém s vysokorychlostním čerpadlem, autosamplerem s chlazením a multikolonovým termostatem
• HILIC kolona InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z (2,1 × 50 mm, 2,7 μm)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s dual spray JetStream ESI zdrojem
• Software Agilent MassHunter Data Acquisition 11.0 a BioConfirm 12.0 pro zpracování dat

Použitá metodika

Oligonukleotidy byly rozpuštěny ve vodě a připraveny v koncentracích 25–100 μM, z nichž se na koloně aplikovalo 25–100 pmol látky. Chromatografické podmínky zahrnovaly gradient mezi mobilní fází A (90 % acetonitrilu, 15 mM octanu amonného) a B (10 % acetonitrilu, 15 mM octanu amonného), průtok 0,4 ml/min, teplotu 30 °C a objem injekce 1 μl. MS/MS analýza v negativním režimu byla provedena v režimu cílené fragmentace (targeted MS/MS), m/z rozsahy 400–3 200 pro MS a 100–3 200 pro MS/MS, rychlost 4 spektra/s pro MS a 1 spektrum/s pro MS/MS. Kolizní energie byly optimalizovány podle prahu m/z 1 500 (12, 15, 18, 20 V pro m/z <1 500; 15, 20, 25, 30 V pro m/z >1 500).

Hlavní výsledky a diskuse

Všechny vzorky vykázaly stabilní retenci mezi 1,5 a 3,5 minuty a bimodální rozložení nábojových stavů. Cílená fragmentace klíčových nábojových stavů zajistila stoprocentní pokrytí sekvence u všech pěti oligonukleotidů:

• 20-mer DNA: nábojové stavy –4 a –8
• 30-mer DNA: nábojové stavy –6, –11 a –12
• ASO (18-mer): nábojový stav –7
• Aptamer (28-mer): nábojové stavy –10 a –11
• 21-mer RNA: nábojové stavy –5 a –9

Vyšší nábojové stavy obecně zlepšily pokrytí, ale pro úplný záznam bylo nutné analyzovat i nejhojnější stavy. Optimalizace kolizní energie ukázala, že je účinnější odvozovat nastavení od m/z fragmentů než od délky řetězce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda HILIC LC/Q-TOF MS/MS bez iontových párů snižuje riziko kontaminace systému iontovými páry, zkracuje dobu reekvilibrace kolony a umožňuje vysokou propustnost analýz. Poskytuje spolehlivé potvrzení sekvence oligonukleotidů, což je neocenitelné pro vývoj antisensových léků, aptamerů a dalších modifikovaných nukleotidů v QA/QC procesech a farmaceutické výrobě.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na širší škálu chemických modifikací a pevnostních vazeb
• Integrace s vysokopropustnými platformami (např. RapidFire) pro screeningové aplikace
• Automatizace a prediktivní optimalizace fragmentačních podmínek s pomocí strojového učení
• Vývoj jednotných protokolů pro standardizaci analýzy oligonukleotidů v regulovaných laboratořích

Závěr

Studie ukazuje, že HILIC LC/Q-TOF MS/MS bez iontových párů je efektivní a všestranná metoda pro potvrzení sekvence oligonukleotidů. Díky optimalizovaným podmínkám chromatografie a cílené fragmentaci lze v krátkém čase dosáhnout stoprocentního pokrytí sekvence u různě dlouhých a modifikovaných oligonukleotidů.

Reference

• 1. Rye P.; Schwarzer C. MS1 Oligonucleotide Characterization Using LC/Q-TOF with HILIC. Agilent Technologies application note, publication number 5994-5631EN, 2023.
• 2. Rye P. High-Throughput, Ion-Pairing-Free, HILIC Analysis of Oligonucleotides Using Agilent RapidFire Coupled to Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry. Agilent Technologies application note, publication number 5994-4945EN, 2022.