Going big, small, and low: semi-prep columns with small particles for polynucleotide applications

Význam tématu

Rozvoj chromatografických metod pro separaci polynukleotidů s vysokým rozlišením je klíčový pro farmaceutický a biotechnologický výzkum, kde se požaduje čistota a charakterizace DNA či RNA pro klinické aplikace, QC a vývoj léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři porovnávají výkon analytických a semi-preparačních kolon o průměru 2,1 mm a 21,2 mm naplněných 4 µm supermakroporézními částicemi divinylbenzenu (DNAPac RP) při separaci dvojité a jednovláknové DNA o délce 10–10 000 párů bází. Cílem je ukázat možnost vysokého rozlišení při nižších lineárních průtocích na běžných (U)HPLC systémech.

Použitá metodika a instrumentace

• Fáze mobilní: 100 mM TEAA v vodu (MP A) a acetonitril (MP B).
• Detekce UV při 260 nm, teplota okolí.
• Kolony: DNAPac RP 2,1×50 mm, 2,1×100 mm (analytické) a 21,2×150 mm (semi-prep).
• Průtoky: analytické 0,2 mL/min, semi-prep 4–8 mL/min.
• Objemy injekce: analytické 1 µL, semi-prep 153 µL až 306 µL.
• Systém: konvenční (U)HPLC s binárním pumpováním, autosamplerem a detektorem bez termoilu.
• Software: Thermo Scientific Chromeleon 7.3 CDS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Obě kolony vykazují podobný rozmezí separace dsDNA od 35 do 10 000 párů bází. Analytická 2,1×100 mm dosahuje téměř baseline rozlišení za ~14 minut.
• Semi-prep 21,2×150 mm zachovává vysokou rozlišovací schopnost i při redukovaném lineárním průtoku (0,08 mL/min), umožňuje baseline separaci krátkých oligonukleotidů (21mer vs 22mer, R=2,94).
• Nižší systémový tlak (~155 bar) a větší objem injekce vedou k vyšší kapacitě vzorku při udržení čistoty.
• Detekce vedlejších variant a nečistot z výroby je možná díky zvýšenému rozlišení, klíčová pro získání vysoce čistého produktu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje efektivní purifikaci a zisk polynukleotidů pro následné biologické či funkční testy, QA/QC a vývoj léčiv. Semi-prep kolony nabízejí vyšší hmotnostní kapacitu při zachování analytického rozlišení a usnadňují škálování procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace gradientů a propojení analytických a preparativních kolon pro zkrácení doby analýz a zvýšení průtoku.
• Integrace frakčního sběru pro cílené získání specifických délek či modifikací nukleotidů.
• Kombinace s ortogonálními technikami (kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie) a funkčními bioassay pro komplexní charakterizaci.

Závěr

Semi-prep kolona DNAPac RP 21,2×150 mm se 4 µm částicemi poskytuje ekvivalentní nebo lepší rozsah separace než standardní analytické formáty, včetně baseline rozlišení krátkých ssDNA s redukovaným tlakem a vyšší kapacitou vzorku. Metoda je plně kompatibilní s běžnými laboratorními (U)HPLC systémy.

Reference

• Ma K., et al. A versatile reversed phase platform for short, intermediate, and long nucleic acid analysis. HPLC 2023, Düsseldorf, Germany.