Evolution of Ion-Exchange columns for biologics characterization

Význam tématu

Ionová výměna (IEX) je klíčová metoda pro charakterizaci biologických léčiv, umožňující rozlišit proteinové varianty podle náboje. Tyto varianty často vznikají post-translačními modifikacemi (deamidace, oxidace, truncate, glykosylace) a ovlivňují imunogenicitu, strukturu, funkci a stabilitu terapeutik, což z nich činí kritické kvalitativní atributy.

Cíle a přehled studie

Studie představuje vývoj a hodnocení iontově-výměnných kolonek Thermo Scientific ProPac 3R SCX a SAX vybavených monodisperzními částicemi 3,0 µm a jejich porovnání s konvenčními 5 µm a polydisperzními stacionárními fázemi. Cílem bylo ověřit rozlišení, citlivost, reprodukovatelnost a škálovatelnost pro charakterizaci monoklonálních protilátek a jiných proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

• HPLC systém Thermo Fisher Scientific s kolonami ProPac Elite WCX (3,0 µm, 5,0 µm) a ProPac 3R SCX/SAX (4×150 mm, 4×100 mm, 10×100 mm).
• Mobilní fáze: 20 mM MES pH 6,5; 20 mM MES + 0,5 M NaCl; 20 mM TRIS pH 8,5 + NaCl pro SAX.
• Detekce UV 280 nm a přímé LC-MS pro identifikaci a stanovení hmotnosti variant.
• PEEK Bio Inert hardware pro analytické formáty a nerezové SST komponenty s povlakem Siltride pro semipreparativní aplikace.
• Frakcionace pomocí fraction collectoru a následná hmotnostní spektrometrie, PTM identifikace a biologické testy.

Hlavní výsledky a diskuse

• Monodisperzní 3,0 µm dosáhla ~16 000 teoretických destiček ve srovnání s ~8 300 a ~4 800 u 5 µm a polydisperzních 5 µm.
• Vysoké rozlišení variant s relativní abundancí menší než 1 % a kvalitní MS spektra pro hlavní špičky i nízkoabundantní frakce (0,4 %).
• Gradientová separace trojice proteinů (cytochrom C, ribonukleáza A, NISTmAb) s ostrými špičkami a minimální variabilitou částic 2,8–3,2 µm.
• Škálovatelnost z 4×100 mm na 10×100 mm při 0,6× průtoku s podobnou výkonností (~10 000–11 600 destiček, asymetrie ~1,27–1,32).
• Kapacita naložení pro NISTmAb ~118 µg/mL objemu vrstvy, celkově ~930 µg na 10×100 mm s konzistentním rozlišením kyselých, hlavních a bazických variant.
• SAX kolonka ProPac 3R umožnila rozlišení Belataceptu s redukovanou komplexitou glykosylací a jasným nabitým profilem v LC-MS.
• Semipreparativní separace Protein G prokázala odolnost plně pokoveného hardware bez vlivu na výkon.
• Robustnost: stabilní výkon více než 1 000 injekcí s minimální změnou parametrů.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivé sledování kritických kvalitativních atributů (CQAs) u monoklonálních protilátek a dalších biologik.
• Přímá kompatibilita s LC-MS pro detailní analýzu post-translačních modifikací.
• Možnost jednoduchého upscalingu do semipreparativního módu pro izolaci a další charakterizaci frakcí.
• Vysoká reprodukovatelnost lot-to-lot a provozní robustnost pro rutinní QA/QC laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových částic a povrchových úprav pro vyšší tlakové režimy a zlepšenou separaci.
• Integrace s pokročilými bioinformatickými nástroji pro automatizovanou analýzu dat.
• Miniaturizace systémů IEX pro rychlé screeningové aplikace v proteomice.
• Multidimenzionální chromatografie (IEX–SEC–HILIC) pro komplexní proteinové charakterizace.
• Adaptace do bezpapírových workflow a regulatorně orientovaných laboratoří.

Závěr

Ion-Exchange kolonky Thermo Scientific ProPac 3R SCX & SAX s monodisperzními 3 µm částicemi poskytují vynikající rozlišení, citlivost a dlouhodobou robustnost pro charakterizaci biologik, nabízejí škálovatelnost od analytických až po semipreparativní aplikace a hladkou integraci s hmotnostní spektrometrií.