Wide-ranging polynucleotide separation capabilities using Reversed Phase particles with variable pore geometry

Význam tématu

Polynukleotidy DNA a RNA jsou klíčové biomolekuly využívané v základním výzkumu, diagnostice, výrobě biologických léčiv a v gene-editing technologiích. Rozvoj účinných chromatografických metod pro separaci a purifikaci nukleových kyselin je nezbytný pro kontrolu kvality, charakterizaci délkových variant a stereochemických forem, které ovlivňují bezpečnost a účinnost terapeutických produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat schopnosti polymerních Reversed Phase (RP) částic s proměnnou geometrií pórů (50–2500 Å) pro rozdělení polynukleotidů v rozsahu délky od desítek až po tisíce nukleotidů. Autoři testovali analytické i semi-preparativní formáty sloupců DNAPac RP (4 µm) a hodnotili vliv teploty, pH a volby iontově párovacích činidel na rozlišení jednotlivých analyzovaných vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Iontově párovaná Reversed Phase (IP-RP) chromatografie pro UV (260 nm) a hmotnostní detekci.
• Mobilní fáze obsahovaly triethylamoniový acetát (TEAA), hexylamoniový acetát (HAA) nebo hexafluorizopropanol (HFIP).
• Analytické sloupce 2,1 × 50 a 2,1 × 100 mm, semi-preparativní formát 21,2 × 150 mm.
• Gradienty objemové složky organického rozpouštědla (acetonitril) přizpůsobené podle objemu kolony.
• Analýzy provedeny na chromatografu Thermo Scientific Vanquish H.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozlišení délkových variant od 10 do 10 000 bazických párů bylo úspěšně dosaženo díky pórům různých velikostí, které optimalizují kinetiku hmotového přenosu.
• Zvýšení teploty až na 60 °C a úprava pH mobilní fáze umožnily doladění retence a rozlišení stereoisomerů (Rp a Sp) u siRNA.
• Polymerní částice byly stabilní v širokém rozsahu pH (1–14) i teplot (do 90 °C), na rozdíl od konvenčních křemičitých fází.
• Přímé škálování metod z analytické na semi-preparativní úroveň potvrdilo srovnatelnou, resp. lepší separační účinnost ve větším měřítku.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysoké rozlišení a flexibilitu při separaci krátkých oligonukleotidů (siRNA, gRNA) i dlouhých transkriptů mRNA. Lze ji využít k QC/výrobní kontrole, izolaci cílových frakcí pro in vitro či in vivo aplikace a ke studiu nízko zastoupených nechtěných variant.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření využití supermakropórózních polymerních fází v automatizovaných škálovatelných systémech pro výzkum a bioprodukci. Integrace s MS detekcí pro komplexní profilování posloupnosti a modifikací nukleových kyselin představuje další směr vývoje. Vývoj biokompatibilních gradientů a aplikace v kontinuální výrobě by mohly zvýšit výtěžnost a efektivitu purifikace terapeutických nukleových kyselin.

Závěr

Nová DNAPac RP fáze se supermakroporózní strukturou ukazuje vynikající schopnost separovat polynukleotidy od 10 do 10 000 BP v analytických i semi-preparativních formátech. Variabilita pórů, chemická stabilita a možnost úpravy pH a teploty zajišťují vysoké rozlišení a robustnost metody pro náročné aplikace v oblasti genové terapie a biotechnologické výroby.

Reference

• Musunuru K. et al. Patient-Specific In Vivo Gene Editing to Treat a Rare Genetic Disease. New England Journal of Medicine, 2025.
• Maurer J. et al. Evaluation of ion pairing reversed-phase liquid chromatography for the separation of large RNA molecules. Journal of Chromatography A, 1740 (2025) 465574.
• Ma K. et al. A versatile reversed phase platform for short, intermediate, and long nucleic acid analysis. HPLC 2023, Düsseldorf, Germany.