High-throughput LC/MS characterization of mRNA therapeutics using a fast DDA method on the Orbitrap Astral MS

Význam tématu

mRNA-terapeutika představují klíčovou platformu v moderní medicíně, zejména u vakcín proti infekčním onemocněním a u léčby genetických či nádorových onemocnění. Precizní analýza struktury, integrity a čistoty mRNA je nezbytná pro vývoj, kontrolu kvality a regulační schvalování těchto inovativních biologických léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout komplexní workflow pro charakterizaci mRNA-terapeutik zahrnující přípravu vzorku, rychlou chromatografii spojenou s LC–MS/MS analýzou a pokročilé zpracování dat. Studie nejprve optimalizovala podmínky na standardní směsi oligonukleotidů (10–55 nt) a následně aplikovala metodu na modelovou mRNA o délce ~3500 nukleotidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Digesce: částečná štěpící reakce RNázy T1 imobilizované na magnetických perlách (inkubace 5–15 minut při 37 °C).
• Chromatografie: DNAPac RP kolona na UHPLC systému Vanquish; gradient 5–20 % methanolu (0,2 % TEA, 1 % HFIP) v čase 15 min (standardy) nebo 30 min (mRNA); teplota 50 °C, průtok 300 µL/min.
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Astral v negativním módu; datově řízená akvizice (DDA) až 45 Hz; tři úrovně krokové kolizní energie (NCE ~18, 23, 28 V).
• Zpracování dat: Thermo Scientific BioPharma Finder 5.2 pro automatickou identifikaci fragmentů, přiřazení sekvenčních zlomů a mapování pokrytí sekvence.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické oddělení fragmentů probíhalo podle velikosti: menší oligonukleotidy eluovaly rychleji, větší později.
• Fragmentační mapování pro nábojové stavy −3 až −7 vykázalo ASR (average structural resolution) blízko hodnoty 1,0, což znamená úplné pokrytí vazeb mezi nukleotidy.
• Cílová mRNA dosáhla celkového sekvenčního pokrytí 88,2 % u unikátních fragmentů a 92,4 % při zahrnutí neunikátních zlomů.
• Vysoká rychlost datové akvizice umožnila detekci nízkoodběrných nečistot a stopových oligonukleotidů v komplexním vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Reprodukovatelný a kontrolovatelný průběh digesce mRNA.
• Rychlé LC–MS/MS rozdělení a identifikace fragmentů s vysokou sekvenční pokrytostí.
• Citlivá detekce nízkoodběrných nečistot a modifikací.
• Možnost nasazení v QA/QC procesech při výrobě mRNA-terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zrychlování akvizice dat a paralelizace fragmentačních cyklů.
• Vylepšení bioinformatických algoritmů pro přesnější identifikaci modifikovaných nukleotidů.
• Integrace s ortogonálními metodami (capillary electrophoresis, nanopore sequencing) pro komplexní charakterizaci.
• Rozšíření workflow na jiné typy nukleových kyselin a jejich chemicky modifikované formy.

Závěr

Vyvinutý workflow kombinuje částečnou digesci RNázy T1, rychlé RP-LC a vysokorychlostní DDA fragmentaci na Orbitrap Astral pro efektivní charakterizaci mRNA-terapeutik. Metoda dosahuje vysokého sekvenčního pokrytí (>92 %), umožňuje detekci stopových nečistot a poskytuje robustní platformu pro výzkum i rutinní kontrolu kvality.

Reference

1. Diedrich J.K.; Pinto A.F.M.; Yates J.R. Energy Dependence of HCD on Peptide Fragmentation: Stepped Collisional Energy Finds the Sweet Spot. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2013.
2. Wei B.; Wang J.; Cadang L.; Goyon A.; Chen B.; Yang F.; Zhang K. Development of an Ion Pairing Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Method for Characterization of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Guide Ribonucleic Acid. J. Chromatogr. A. 2022.
3. Vanhinsbergh C.J.; Criscuolo A.; Sutton J.N.; Murphy K.; Williamson A.J.K.; Cook K.; Dickman M.J. Characterization and Sequence Mapping of Large RNA and mRNA Therapeutics Using Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2022.
4. Criscuolo A.; Arrey T.; Williamson A.J.K.; Cook K.; Murphy K.; Sutton J.N.; Harder A.; Shofstahl J.; Sanders M. Characterization of mRNA Therapeutics Using a Novel LC-MS Based Workflow. ASMS 2021.