mRNA direct sequence mapping using automated partial digestion with magnetic nuclease and LC-HRMS

Význam tématu

V posledních letech roste význam mRNA v oblasti vakcín a terapeutik, zejména po úspěchu SARS-CoV-2 vakcín. Dlouhé lineární oligoribonukleotidy s bohatou sekundární strukturou a chemickými modifikacemi vyžadují pokročilou analytiku pro ověření identity, integritu a přítomnost nečistot. Přímá LC-HRMS sekvenční analýza mRNA přináší detailní pohled na strukturu bez nutnosti reverzní transkripce a PCR amplifikace.

Cíle a přehled studie

Studie představuje vývoj a validaci plně automatizovaného workflow pro přímou sekvenční analýzu mRNA metodou LC-HRMS. Hlavní cíle:

• Reprodukovatelná a řízená částečná digesce RNase T1 pro tvorbu unikátních fragmentů 10–50 nukleotidů.
• Optimalizovaná IP-RP chromatografie pro vysoké rozlišení oligonukleotidů.
• HRAM MS/MS analýza pro přesné určení sekvence a modifikací.
• Automatizovaná data anotace a mapování v BioPharma Finder 5.0.

Použitá metodika a instrumentace

Částečná digesce: 20–40 µg mRNA inkubováno s RNase T1 navázanou na magnetických nosičích (SMART Digest Bulk RNase T1) po dobu 5–15 min při 37 °C. Automatická manipulace na KingFisher Duo Prime. IP-RP-HPLC: DNAPac RP kolona (100×2,1 mm), eluentní systém 0,2 % triethylamin/50 mM HFIP v A a 20 % acetonitril v B, teplota 60 °C, průtok 0,2 mL/min. MS/MS: Orbitrap Exploris 240, DDA mód, MS1 rozlišení 120 000, MS2 rozlišení 30 000, stepped HCD (15/18/21 eV), m/z rozsahy 450–3 000 (MS1) a 150–2 000 (MS2). Data zpracována v BioPharma Finder 5.0: max. hmotnost 25 000 Da, min. důvěra 0,5, masa 10 ppm, specifika RNase T1 strict, variabilní modifikace 3′ fosfát a cyklický fosfát.

Použitá instrumentace

• Vanquish Horizon UHPLC (s Pump H, Sampler HT, Column Compartment H, DAD HL a LightPipe buňkou)
• DNAPac RP kolona 100×2,1 mm
• Orbitrap Exploris 240 MS
• KingFisher Duo Prime pro automatizaci digesce

Hlavní výsledky a diskuse

• Částečná digesce poskytla stabilní chromatogramy a reprodukovatelné sekvenční pokrytí (eGFP mRNA 70,6 % ±1,7 %).
• SARS-CoV-2 spike mRNA dosáhla >89 % pokrytí, eGFP až 86,2 % (bez polyA až 95,9 %).
• Rozsah fragmentů 10–50 nt zajišťuje unikátní mapování a rozlišení isomerů.
• Metoda rozpoznala modifikovaná nukleotidy 5-methoxyuridin s >90 % pokrytím.
• Celkový čas přípravy a analýzy vzorku ~90 minut.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přesná kontrola identity a integrity mRNA vakcín/terapeutik.
• Detekce chemických modifikací a nečistot bez potřeby RT/PCR.
• Robustní automatizace vhodná pro QC laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace dalších nukleáz a optimalizace fragmentačního rozsahu.
• Vyšší throughput díky paralelizaci a on-line analyzátorům.
• Rozšíření na nové typy modifikovaných RNA a další terapeutické aplikace.
• Vylepšení softwarové anotace pro rychlejší reporting a integraci AI nástrojů.

Závěr

Vyvinuté semi-automatizované LC-HRMS workflow nabízí řízenou částečnou digesci RNase T1 na magnetických nosičích, vysokorozlišovací IP-RP chromatografii a pokročilou MS/MS analýzu s automatizovanou anotací v BioPharma Finder. Metoda dosahuje vysokého pokrytí mRNA sekvencí, včetně modifikovaných, za krátký čas a poskytuje robustní nástroj pro vývoj a QC mRNA vakcín a terapeutik.

Reference

• Dickman M. a kol. mRNA direct sequence mapping using automated partial digestion with magnetic nuclease and LC-HRMS. Customer application note 000723, Thermo Fisher Scientific, 2022.