Characterization of mRNA Therapeutics Using a Novel LC-MS Based Workflow

Význam tématu

Charakterizace mRNA léčiv pomocí spolehlivých analytických metod je zásadní pro vývoj vakcín a terapeutik, jak ukázala pandemie COVID-19. LC-MS analýza umožňuje detailní mapování mRNA sekvence a identifikaci kritických kvalitativních parametrů, jako jsou modifikace nukleotidů a unikátnost sekvenčních fragmentů.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout workflow pro částečnou enzymatickou digesci mRNA s přesnou kontrolou času štěpení, optimalizovat chromatografické a hmotnostní podmínky pro maximální sekvenční pokrytí a následnou analýzu fragmentů. Studie demonstruje, jak řízená digesce pomocí RNázy T1 na magnetických kuličkách vede k tvorbě unikátních oligonukleotidů vhodných pro LC-MS/MS mapování.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala:

• Enzymatickou digesci mRNA (3500 bází) s RNáza T1 na magnetických kuličkách při 37 °C, časy 5–30 minut, optimálně 15 minut.
• Zastavení reakce magnetem nebo automatickým systémem KingFisher Duo Prime a okyselení formiátovou kyselinou.
• Chromatografii na DNAPac RP kolonce (Vanquish UHPLC): gradient 5–20 % methanolu s 0,2 % TEA a 1 % HFIP, 40 minut, 50 °C.
• MS a MS/MS analýzu na Orbitrap Exploris 240, negativní ionizace, Full MS (120 000 rozlišení) a datově řízené MS/MS (30 000 rozlišení, stepped HCD).
• Bioinformatickou analýzu a anotaci fragmentů v Biopharma Finder, včetně generování důvěryhodnostních skóre a map sekvenčního pokrytí.

Hlavní výsledky a diskuse

Částečná digesce trvající 15 minut poskytla optimální poměr délky fragmentů (5–43 bází) a vysoké množství vysoce specifických úniků (missed cleavages). Chromatografická separace prokázala korelaci retence se velikostí fragmentu a umožnila rozlišení izomerů. MS/MS identifikace poskytovala sekvenční potvrzení s minimem přeznačení. Při aplikaci filtru důvěryhodnosti nad 85 % bylo dosaženo až 91% pokrytí mRNA sekvence (89 % unikátních fragmentů).

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí:

• Přesnou kontrolu délky a specifičnosti fragmentů díky řízené digesci RNázy T1.
• Vysoce citlivou a specifickou LC-MS/MS detekci pro validaci mRNA terapie.
• Možnost rychlé optimalizace analytických podmínek a kontroly kvality ve farmaceutickém vývoji a QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Systémy pro automatizovanou digesci a pokročilá bioinformatická řešení budou dále zvyšovat rychlost i kvalitu charakterizace mRNA. Integrace ion mobility separace či nové kvantitativní přístupy mohou rozšířit možnosti detekce modifikací a zlepšit standardizaci analýzy mRNA léčiv.

Závěr

Popsaný LC-MS/MS workflow pro řízenou digesci mRNA poskytuje robustní metodu pro detailní sekvenční mapování s vysokým pokrytím a specifitou. Tato strategie podporuje vývoj a kontrolu kvality moderních mRNA léčiv a vakcín.