Oligonucleotide sequencing by LC-MS/MS

Význam tématu

Charakterizace oligonukleotidů pomocí LC-MS/MS představuje klíčovou metodu pro kontrolu kvality mRNA vakcín a bioterapeutik. Rychlá a spolehlivá sekvenační analýza mRNA je zásadní pro ověření správné sekvence, detekci možných modifikací a zajištění konzistence výroby. Díky vysoké přesnosti hmotnostní spektrometrie lze získat detailní informace o fragmentaci a sekundární struktuře molekuly, což významně přispívá k bezpečnosti a účinnosti mRNA léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie je představit novou metodiku LC-MS/MS pro detailní sekvenování oligonukleotidů až do délky 60 a více nukleotidů. Autoři demonstrují optimalizaci chromatografických a hmotnostně spektrometrických podmínek, včetně volby ion-pair činidel (HFIP/TEA), nastavení pH a řízené fragmentace (HCD) s krokovanou kolizní energií. Zvláštní pozornost je věnována parciálnímu štěpení mRNA pomocí RNázy T1 v mobilizované podobě, které zajišťuje reprodukovatelné a analyticky výhodné štěpné vzory.

Použitá metodika

Vzorek mRNA je nejprve parciálně digesován pomocí RNázy T1 navázané na magnetické kuličky. Takto řízené štěpení umožňuje získat fragmenty v rozsahu 10–60 nukleotidů, vhodné pro sekvenační analýzu. Chromatografická separace probíhá na RP UHPLC kolónách s ion-pair mobilní fází obsahující triethylamin (TEA) a hexafluoroisopropanol (HFIP). Koncentrace HFIP je optimalizována (20–80 mM) pro zlepšení retence a zúžení nábohových stavových rozdělení. Detekce a fragmentace probíhají na Orbitrap Exploris v negativním módu s rozlišením až 240 000 a krokovanou NCE (10–24), čímž se dosahuje vysokého pokrytí sekvence.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific SMART Digest RNase T1 magnetic beads
• Thermo Scientific DNAPac RP UHPLC columns
• Thermo Scientific Vanquish UHPLC System
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris Mass Spectrometer
• Softwary Thermo Scientific BioPharma Finder 5.1 a Chromeleon 7.3

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované koncentrace HFIP a TEA vedou k vyrovnanějšímu nábohovému rozdělení a lepší retenci fragmentů. Krokovaná HCD fragmentace umožňuje dosáhnout ASR (Average Structural Resolution) blízko hodnoty 1, zejména u vyšších nábojových stavů, čímž se zvyšuje sekvenační pokrytí až do velikosti 60 a více nukleotidů. Parciální štěpení pomocí RNázy T1 na magnetických kuličkách prokazuje vysokou reprodukovatelnost fragmentačního vzoru a minimalizuje kontaminaci analytického systému. Metoda rovněž rozlišuje sekvenční izomery a detekuje známé modifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přesná verifikace primární sekvence mRNA vakcín.
• Kvalitativní a kvantitativní kontrola fragmentačního vzoru jako QC test.
• Možnost sledování strukturních vlastností mRNA (sekundární struktura).
• Jednoduché škálování pro rutinní laboratorní workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat automatizaci přípravy vzorků, zrychlení chromatografických postupů a rozšíření softwarové podpory pro analýzu více typů enzymatických štěpení. Integrace metody do výrobních linek mRNA vakcín umožní on-line monitoring kvality a rychlejší detekci variant. Rozvoj nových ion-pair činidel a vylepšeného hardwaru může zvýšit citlivost a rozsah analyzovaných fragmentů.

Závěr

Navržená LC-MS/MS metoda kombinující parciální štěpení RNázy T1, optimalizované ion-pair chromatografii a krokovanou HCD fragmentaci poskytuje spolehlivé a detailní sekvenační údaje pro mRNA vakcíny a bioterapeutika. Díky vysoké reprodukovatelnosti, schopnosti detekovat izomery i modifikace a rutinnímu průběhu analýzy (cca 60 minut) je metoda vhodná pro aplikace QA/QC a výzkumné účely.

Reference

Vanhinsbergh C., et al. Characterization and Sequence Mapping of Large RNA and mRNA Therapeutics Using Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2022, 94, 20, 7339–7349.