Myth busting: “You cannot sequence oligonucleotides over 20 to 30 nucleotides long by LCMS/MS” Learn how to routinely sequence 100 nt oligonucleotides

Význam tématu

Důkladné mapování a ověřování pořadí nukleotidů v dlouhých oligonukleotidových terapeutikách (do 100 nt) je kritické pro identifikaci, validaci sekvence a analýzu nečistot. Překonání hranice 20–30 nt rozšiřuje analytické možnosti u mRNA, gRNA nebo siRNA.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vyvinout a optimalizovat metodu LC-HRMS s vysokým rozlišením pro přímé sekvenování velkých oligonukleotidů až do délky 100 nt s 100% pokrytím, včetně testu vhodnosti systému na standardní směsi ssDNA.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: syntetické modifikované RNA a standardní 6-komponentní ssDNA (10, 20, 30, 40, 50, 55 mer) v koncentraci 1 mg/ml.
• UHPLC: DNAPac RP kolona, eluenty TEA/HFIP ve vodě a acetonitrilu, vysoké pH (9,5–10), průtok 0,3 ml/min, 50 °C.
• MS: Orbitrap Exploris 240, HCD fragmentace se stupňovanými energiemi (např. 13,17,19 NCE), optimalizovaná pro vyšší nabité stavy.
• Software: Thermo Scientific BioPharma Finder pro identifikaci, mapování sekvence a anotaci nečistot.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografie dosahuje základního rozlišení ssDNA standardů (10–100 nt).
• Vyšší nabité stavy (z = –11) ve spojení s nižšími energiemi HCD poskytují nejlepší ASR (1,0).
• Optimalizace eluentů s vysokým pH zvyšuje podíl nabitých iontů, čímž zlepšuje sekvenační pokrytí.
• Přímé sekvenování 100meru s ASR 1,0 pro tři různé nabité stavy potvrzuje možnost rutinní analýzy bez štěpení.
• Příliš nízké nebo vysoké fragmentační energie vedou k nedostatečné nebo nadměrné fragmentaci u delších oligonukleotidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přímá identifikace a validace dlouhých oligonukleotidových terapeutik.
• Omezení potřeby enzymatického štěpení.
• Využití v QA/QC, vývoji léčiv a kontrole nečistot.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na složitější a delší RNA molekuly (gRNA, long non-coding RNA).
• Automatizace datové analýzy a optimalizace filtrů pro eliminaci falešných pozitiv.
• Integrace do výrobních QC procesů v biotechnologickém průmyslu.
• Adaptace na další vysokorozlišovací MS platformy a nové ionizační techniky.

Závěr

Vyvinutá LC-HRMS metoda s vysokým pH eluentů a optimalizovanou HCD fragmentací na Orbitrap Exploris 240 umožňuje rutinní přímé sekvenování oligonukleotidů do délky 100 nt s plným pokrytím. Metoda je robustní, jednoduchá a zefektivňuje analýzu dlouhých terapeutických nukleových kyselin.

Reference

• Vanhinsbergh et al. (2022), Characterization and Sequence Mapping of Large RNA and mRNA Therapeutics Using Mass Spectrometry, Analytical Chemistry 94(20):7339-7349