Intact Analysis of Biopharmaceuticals by Hydrophobic Interaction/Reversed Phase 2D-LC/MS System

Význam tématu

Hydrofobní interakční chromatografie doplněná dvoudimenzionálním LC/MS představuje pokročilou metodu pro analýzu celých biokomplexů, zejména monoklonálních protilátek a konjugátů protilátka-lék. Zachování nativní struktury během separace a přesné stanovení modifikací jako oxidace nebo různých formátů navázaného nákladu zajišťuje spolehlivé posouzení kvality a účinnosti bioléčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat integrační přístup spojující HIC jako první dimenzi pro selekci proteoform a reverzní fázovou chromatografii s TOF MS ve druhé dimenzi. Ukazujeme aplikaci této platformy na:

• oxidačně upravené monoklonální protilátky (mAb),
• lysinem vázané ADC (antibody-drug conjugates).

Použitá metodika a instrumentace

Pro první dimenzi byla použita kolona Agilent AdvanceBio HIC (4,6×100 mm, 3,5 μm) s pufrem na bázi fosfátu a tartrátu v pH 7.0. V druhé dimenzi se aplikovala reverzní fáze na kolóně Agilent AdvanceBio RP-mAb C4 (2,1×50 mm) při vysoké teplotě (80 °C) a gradientním přechodu mezi vodou s kyselinami a organickým rozpouštědlem. Vícedílné tzv. heart-cutting separace se provádějí pomocí dvoupolohového ventilu s čtyřportovou konfigurací a smyčkami (40 μl). Detekce probíhá na TOF LC/MS systému Agilent 6224 s duálním ESI zdrojem.

Hlavní výsledky a diskuse

U oxidačně ošetřené mAb se v HIC chromatogramu objevila nová špička odpovídající kovalentním modifikacím. Hmotnostní měření potvrdilo navýšení hmotnosti o ~64 Da, což odpovídá čtyřem oxidacím. V případě lysinem konjugovaných ADC odhalila MS více izomerů s DAR (drug-to-antibody ratio) od 0 do 8. Různé DAR a polohové izomery vykazovaly rozdílné retenční doby v HIC, což naznačuje selektivní afinitu k hydrofobnímu matrici.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost zachovat nativní konformaci bílkovin díky nedenzujícmu prostředí HIC.
• Rozlišení a kvantifikace drobných populací proteoform a ADC isoform v jednom běhu.
• Online desolvatace a separace s přímým napojením na MS pro přesnou hmotnostní analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj 2D-LC platforem s vyšší kapacitou heart-cuttingu a integračním softwarovým řízením pro automatizaci analýz bioléčiv. Přínosem bude také kombinace s pokročilými detektory (QTOF, Orbitrap) pro hlubší charakterizaci glykoform a posttranslačních modifikací.

Závěr

Implementace HIC/RP-2D-LC/MS umožňuje komplexní a citlivou analýzu intact biopharmaceuticals. Představuje efektivní řešení pro rutinní i výzkumné laboratorní aplikace, poskytuje spolehlivá data pro kontrolu kvality a podporu vývoje nových léčiv.

Reference

• Staples G. Analysis of monoclonal antibodies using MHC 2D-LC/MS. Agilent Technologies, Application Note 2014, 5991-6376EN.