Characterization of Antibody‑Drug Conjugates Using 2D-LC and Native MS

Význam tématu

Antibody drug conjugates jsou monoklonální protilátky navázané na cytotoxickou malou molekulu pomocí syntetického linkeru. Poměr navázaných molekul léku na protilátku neboli DAR je klíčovým kritickým atributem kvality, který ovlivňuje terapeutickou účinnost i bezpečnost. Heterogenní distribuce míry konjugace a citlivost na organické a kyselé podmínky však komplikují jejich analýzu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout inovativní dvoudimenzionální LC workflow kombinující HIC, multiple heart-cutting, on-line SEC a nativní MS pro komplexní charakterizaci intact ADC včetně přesného stanovení DAR. Studie využívá Agilent 1290 Infinity II 2D-LC systém, Agilent 6545XT AdvanceBio LC Q-TOF a software MassHunter Workstation 11.0 s modulem BioConfirm.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje první dimenzi v HIC s kolonou AdvanceBio HIC (4.6×100 mm 3.5 μm) při pH 7 a gradientu amonných solí. Frakce DAR variant se sbírají pomocí multiple heart cutting. Druhá dimenze probíhá v denaturačním režimu na RP PLRP-S kolona (2.1×50 mm 5 μm) s kyselinou mravenčí a acetonitrilem nebo v nativním režimu na AdvanceBio SEC kolona (4.6×300 mm 1.9 μm) v 100 mM octanu amonném. Detekce probíhá na Agilent 6545XT LC Q-TOF s Jet Stream ESI a rozšířeným m/z rozsahem do 30000. Software MassHunter Workstation 11.0 řídí 2D-LC i MS a file splitter utility rozděluje výsledný soubor na jednotlivé LC MS data.

Hlavní výsledky a diskuse

HIC separace umožnila rozlišení ADC variant DAR 0 až DAR 8. Denaturační LC MS odhalilo vysokou míru degradace a disociace protilátek na lehké a těžké řetězce s různými počty navázaných léků. Nativní 2D-LC/MS s on-line SEC zachoval intact komplex a přinesl ostré m/z signály s nábojem 16+ až 27+ a vysokým rozlišením glykozylovaných forem. DAR 0 až DAR 6 byly přesně určeny s hmotnostní chybou v řádu jednotek ppm. DAR 8 nebylo možné detekovat kvůli nízké koncentraci a zvýšené degradaci.

Přínosy a praktické využití metody

Nové řešení přináší přesnou a robustní determinaci DAR bez artefaktů degradace, zachování nativní struktury ADC, zkrácení doby měření díky single-software řízení a automatizované práci s daty. Metoda je vhodná pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik a stability konjugátů v průmyslové a akademické praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na další typy proteinových konjugátů, studium protein-ligand interakcí, vylepšení SEC a HIC kolony s vyšší účinností a rozšířením m/z, automatizace MDLC workflow a přímá integrace datové analýzy s umělou inteligencí pro online monitorování kritických atributů kvality.

Závěr

Vyvinuté 2D-LC workflow spojující HIC, SEC a nativní MS s jedním softwarem umožňuje přesnou a opakovatelnou charakterizaci intact ADC a validní stanovení DAR hodnot. Minimalizuje degradaci, zrychluje analýzu a nabízí široké možnosti aplikace v biotechnologickém průmyslu.

Reference

• Ross PL et al Physical and Chemical Stability of Antibody Drug Conjugates Current Status Journal of Pharmaceutical Sciences 2016 105 391 397
• Schneider S High Salt High Reproducibility Analysis of antibody drug conjugates using hydrophobic interaction chromatography with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System Agilent Technologies application note 5994 2691EN 2020
• Van de Donk NWCJ Dhimolea E Brentuximab Vedotin mAbs 2012 4 458 465
• Wong D Sensitive Native Mass Spectrometry of Macromolecules Using Standard Flow LC MS Agilent Technologies application note 5994 1739EN 2020
• Wong D Mass Spectrometric Characterization of Antibody siRNA Conjugates using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC Q TOF Agilent Technologies application note 5994 2155EN 2020