Analysis of Monoclonal Antibodies

Význam tématu

Hydrophobic interaction chromatography (HIC) je klíčovou technikou pro separaci a charakterizaci monoklonálních protilátek (mAb) a jejich konjugátů (ADC). Díky schopnosti rozlišit varianty lišící se povrchovou hydrofobicitu, jako jsou izomery, oxidované formy či různé stupně konjugace, HIC významně přispívá ke kontrole kvality bioterapeutik. Kombinace HIC s hmotnostní spektrometrií (MS) dále rozšiřuje možnosti identifikace a kvantifikace těchto variant.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat platformu Agilent 1290 Infinity 2D-LC MHC, která umožňuje více srdcových odběrů (multiple heart-cutting) z HIC separace následované on-line desaltingem a RP chromatografií s TOF MS detekcí. Metodu autoři ověřili na třech modelech: intactní mAb, nuceně oxidované mAb a Lys-vázaném ADC.

Použitá metodika

1. První dimenze: HIC separace s pufrem 50 mM fosfát, pH 7, a 2 M ammonium tartrate jako eluentem pro narušení interakcí.
2. Multiple heart-cutting: vybrané frakce byly ukládány do 40 μL smyček a přepínány ventilem 2-pozice/4-port duo pro pozdější injekci.
3. Druhá dimenze: RP separace na AdvanceBio mAb C4 kolonce při 80 °C s gradientem acetonitril/1-propanol/voda obsahující 0,5 % acetonitrilové a 0,05 % trifluoroctové kyseliny.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary Pump (1D HIC)
• Agilent 1290 Infinity Binary Pump (2D RP)
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Autosampler s termostatem
• Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment
• Agilent 1290 Infinity Valve Drive s 2-pozice/4-port duo MHC ventilem a 2×6 smyčkami (40 µL)
• Agilent 1290 Infinity DAD detektor (280 nm)
• Agilent 6224 TOF LC/MS se zdrojem dual-nebulizer ESI

Hlavní výsledky a diskuse

- Intactní mAb A: detekovány truncované formy s hmotnostními posuny −9948,8 a −539,4 Da a izomery beze změny hmotnosti, odlišné hydrofobicity.
- Oxidovaná mAb B: nové špičky v HIC chromatogramu; MS ukázala +64 Da, odpovídající čtyřnásobné oxidaci methioninů.
- Lys-vázaný ADC C: špatně rozlišená 1D špičková skupina, 8 heart-cut frakcí pro DAR 0–8, včetně glykoform a volného linkeru.
Data potvrzují vysokou desaltingovou účinnost platformy a schopnost selektivního odběru a přesného měření hmotnosti i při nízkých objemech vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

2D-LC s více srdcovými odběry umožňuje optimalizovat RP separaci nezávisle na HIC, což usnadňuje on-line desalting a citlivou MS detekci proteinů a ADC. Metoda minimalizuje spotřebu vzorku, zkracuje čas analýzy a poskytuje detailní charakterizaci kritických kvalitativních atributů (CQA).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření ve top-down proteomice, detailní analýza posttranslačních modifikací a kombinace s automatizovanými nástroji pro datovou analýzu. Rozvoj modulárních 2D systémů a vyšší propustnost by mohly zlepšit validaci a rutinní kontrolu v rámci farmaceutického výzkumu a výroby.

Závěr

Popsaná Agilent 1290 Infinity MHC 2D-LC/MS platforma účinně spojuje HIC a RP separaci s MS detekcí, což výrazně rozšiřuje možnosti charakterizace mAb a ADC. Metoda nabízí vysokou selektivitu, účinné desaltingové kroky a citlivou hmotnostní analýzu, nezbytnou pro komplexní hodnocení bioterapeutik.

Reference

1. Buckenmaier S. Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution for Multiple Heart-Cutting. Agilent Technologies Technical Overview 5991-5615EN, 2015.
2. Xiu L. et al. Effective Protein Separation by Coupling HIC and RP for Top-down Proteomics. Anal. Chem. 2014, 86, 7899-7906.