Význam tématu

Biomolekulární systémy s multivalentními vlastnostmi, jako jsou monoklonální protilátky či aptamery, hrají zásadní roli v moderní farmaceutické praxi. Přesné určení vazebné afinity a absolutní stechiometrie komplexů je klíčové pro pochopení mechanismu účinku, optimalizaci terapeutických účinků a vývoj nových léčiv. CG-MALS (composition-gradient multi-angle light scattering) umožňuje spolehlivou analýzu těchto složitých interakcí přímo v roztoku bez nutnosti značení nebo imobilizace.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo:

• kvantifikovat vazebnou afinitu DNA aptameru ke streptavidinu,
• určit absolutní stechiometrii výsledného komplexu,
• ověřit rovnocennost vazebných míst a případnou kooperativitu mezi nimi.

Modelový systém tvořil tetramerický streptavidin a specifický DNA aptamer. Pro analýzu interakcí byly připraveny tři kompoziční gradienty: dva jednosložkové k vyhodnocení samointerakcí a jeden „crossover“ pro hetero-asociaci.

Použitá metodika a instrumentace

Pro automatizované vytváření gradientů a sběr dat byl použit systém Calypso II. Signál světelného rozptylu sbíral přístroj HELEOS II MALS a současně probíhalo měření koncentrace UV detektorem. Pro každou složku se injektovalo 0,8 mL roztoku a bylo zaznamenáno ustálené světelné rozptylové spektrum při zajištěné rovnováze.

Hlavní výsledky a diskuse

• Monomerní molekulové hmotnosti streptavidinu (~53 kDa) a aptameru (~10 kDa) odpovídaly teoretickým hodnotám a nezávisely na koncentraci, což vyloučilo samointerakce.
• Hetero-asociační data odhalila neočekávanou stechiometrii 1:2 (SA:Aptamer), nikoli předpokládanou 1:4 podle tetramerické struktury streptavidinu. Tento výsledek naznačuje, že streptavidin může existovat jako dimer dimerů, přičemž aptamer rozpoznává dimerickou jednotku.
• Vazebná afinit dosažená KD hodnotou 190 nM byla rovnoměrná na každé ze dvou identifikovaných vazebných míst a neprojevila se žádná kooperativita či sterické omezení.

Přínosy a praktické využití metody

CG-MALS umožňuje měření vazebné afinity a absolutní stechiometrie přímo v roztoku bez nutnosti značení, imobilizace či dalšího modifikování vzorků. Metoda je vhodná pro komplexní biomakromolekulární interakce, poskytuje absolutní molární hmotnost a detailní přehled o složkách systému v rovnováze.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření CG-MALS na studium dalších multivalentních systémů, integraci s hmotnostní spektrometrií a mikrodalším formátech pro vyšší propustnost. Kombinace s výpočetními modely a simulacemi nabídne hlubší vhled do mechanismu vazby a dynamiky komplexních biomolekul.

Závěr

CG-MALS automatizované systémem Calypso poskytuje unikátní přístup k simultánnímu stanovení vazebné afinity a absolutní stechiometrie v roztoku. Studie prokázala neočekávanou 1:2 vazebnou stechiometrii aptameru ke streptavidinu a jednotnou afinitu KD = 190 nM, což by nebylo možné měřit standardními povrchovými či značkovacími metodami.

Použitá instrumentace

• Calypso II pro generování kompozičních gradientů
• HELEOS II multi-angle light scattering detector
• UV detekční systém pro stanovení koncentrace

Reference

1. Bing T. et al. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 1798.
2. Ruigrok V.J. et al. Chem. Biochem. 2012, 13, 829.