SEC-MALS and CG-MALS: Complementary Techniques to Characterize Protein-DNA Complexes

Význam tématu

Protein-DNA interakce jsou klíčové v mnoha biologických procesech od virové integrace genetického materiálu až po rekombinaci DNA během meiózy. Precizní určení afinity, stechiometrie a kooperativity těchto komplexů je nezbytné pro pochopení mechanismů interakce a vývoj cílených terapeutik v oblasti antivirotik, onkologických i genetických léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo ukázat kombinované použití dvou technik multiúhlového rozptylu světla (MALS) pro charakterizaci protein-DNA komplexů:

• SEC-MALS v kombinaci s analýzou protein-konjugátů pro stanovení celkové molární hmotnosti komplexu a podílu DNA.
• Kompoziční gradientová CG-MALS pro kvantifikaci stechiometrie a afinity na jednotlivých vazebných místech.

Studie zahrnuje dva modelové systémy: komplex integrázy foamy viru (PFV IN) s U5 virovou DNA a interakci recombinázy Cre s loxP sekvencí při různém pH.

Použitá metodika a instrumentace

Pro SEC-MALS:

• Kolona Superdex 200 10/300 GL
• Detektory: UV absorbance (280 nm), multiúhlový rozptyl DAWN MALS, diferenční refraktometr Optilab dRI
• Software ASTRA s modulem Protein Conjugate Analysis

Pro CG-MALS:

• Systém Calypso pro přípravu gradientů koncentrací
• Inline UV detektor (260 a 280 nm) a DAWN MALS
• Software CALYPSO pro analýzu interakcí

Hlavní výsledky a diskuse

SEC-MALS potvrdilo molární hmotnost komplexu PFV IN–U5 DNA odpovídající krystalové struktuře intasomu (4 monomery proteinu + 2 × 19 bp DNA). Protein conjugate analysis poskytla frakce proteinu a DNA bez předchozího odhadu jejich poměru.

CG-MALS ukázalo u Cre-loxP při pH 7,5 následující: vazba dvou Cre na jednu loxP se silnou pozitivní kooperativitou (Kd1 ≈ 170 nM, Kd2 ≈ 19 nM) a následnou synapsí dimerů do tetrameru (4:2) s Kd ≈ 400 nM. Pomalá kinetika asociace byla sledována přímo ze signálu světelného rozptylu.

Při pH 9,5 kooperativita i synapse zmizely, zůstala pouze nevýznamná 2:1 stechiometrie Cre:loxP (Kd ≈ 24 nM) bez vyšších řádů asociace.

Přínosy a praktické využití metody

• SEC-MALS-UV-dRI poskytuje absolutní molární hmotnosti a složení bez označování vzorků.
• CG-MALS umožňuje stanovit stechiometrii, afinitu i kinetiku vícenásobných vazeb v roztoku.
• Metody jsou univerzálně použitelné pro další biomakromolekulární komplexy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření CG-MALS a SEC-MALS do analýzy složitějších systémů v oblasti membránových proteinů, biologických léčiv, opakovaných makromolekul a vícesložkových interakcí. Integrace real-time kinetiky s vysokou citlivostí světelného rozptylu bude klíčová pro vývoj nových terapeutik.

Závěr

Kombinace SEC-MALS protein conjugate analysis a CG-MALS představuje komplexní přístup k biochemické charakterizaci protein-DNA interakcí. Metody nabídly přesné stanovení molární hmotnosti, složení, kooperativity a kinetiky svazování bez nutnosti modifikací vzorků.

Reference

• [1] Gupta K., Van Duyne G., Structure 20, 1918–1928 (2012).
• [2] Morimoto J. et al., Bioconjugate Chemistry 25, 1479–1491 (2014).
• [3] Berguig G.Y. et al., Molecular Pharmaceutics 9(12), 3506–3514 (2012).
• [4] Peng Y., Zhang L., J. Biochem. Biophys. Methods 30, 243–252 (2003).
• [5] Kenrick S., Chen M., Wyatt Technology App. Note (2014).
• [6] Slotboom D.J. et al., Methods 46(2), 73–82 (2008).
• [7] Ghosh K. et al., J. Biol. Chem. 282(33), 24004–24016 (2007).
• [8] Pallesen J. et al., Nature Microbiology 9(1), 2016 (2016).
• [9] Hastie K., Saphire E.O., Wyatt Technology App. Note (2015).
• [10] Zhao M. et al., Nature 518, 61–67 (2015).
• [11] Some D., Biophysical Reviews 5(2), 147–158 (2013).
• [12] Arora J. et al., mAbs 8, 1561–1574 (2016).
• [13] Halling D.B. et al., J. Gen. Physiology 143(2), 231–252 (2014).
• [14] Attri A.K. et al., Biophys. Chem. 148(1–3), 28–33 (2010).
• [15] Martos A. et al., Biochemistry 49(51), 10780–10787 (2010).
• [16] Mitchell S.L. et al., BMC Microbiol. 15(59), 1–16 (2015).
• [17] Zhu H.L. et al., J. Biol. Chem. 285(6), 3592–3599 (2010).
• [18] Gaulding J.C. et al., Macromolecules 45(1), 39–45 (2012).
• [19] Crichlow G.V. et al., EMBO J. 27, 277–289 (2008).