Metacomplex Formation & Binding Affinity of Multivalent Binding Partners

Význam tématu

Multivalentní vazby mezi makromolekulami hrají klíčovou roli v biologických procesech, jako jsou buněčné signální dráhy, imunitní reakce či samoorganizace strukturálních prvků. Tradiční metody (SPR, ELISA) vyžadují imobilizaci jednoho partnera na povrchu, což při multivalentních interakcích zavádí významné chyby v měření afinity a stoichiometrie. CG-MALS (composition-gradient multi-angle light scattering) umožňuje sledovat vazby zcela v roztoku, což vede k přesnému stanovení afinit a komplexních stechiometrií bez artefaktů povrchové imobilizace.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo charakterizovat vytváření metakomplexů mezi homo-tetramerní streptavidin (SA) a bivalentním anti-streptavidin protilátkou (Ab). Pomocí CG-MALS se hodnotil vliv multivalence na stavební jednotky komplexů, jejich stechiometrii a afinitu v roztoku. Byly testovány tři modely vazby: nekonečná 1:1 asociace (ISA), zdokonalený model ISA s přídavnými 1:2 a 2:1 komplexy a konečný „2×2“ model zahrnující všechny možné 1:1, 2:1, 1:2, 2:2 atd. vazby.

Použitá metodika a instrumentace

Interakce se sledovaly v roztoku při automatizovaných složení gradientu:

• Calypso® composition-gradient systém
• Inline UV/Vis detektor koncentrace
• DAWN® MALS detektor
• Software CALYPSO™ pro řízení experimentu a analýzu dat

Monokomponentní gradienty určily sebeasociaci každého proteinu a dvoukomponentní „crossover“ gradient odhalil hetero-komplexy. Roztoky SA a Ab (10 μg/mL) byly filtrovány na 0,02 μm a analyzovány při zastaveném průtoku pro dosažení rovnováhy.

Hlavní výsledky a diskuse

Naměřená světlost odráží hmotnostní průměrnou molární hmotnost (Mw) roztoku. Při hetero-asociaci se Mw výrazně zvýšila nad úroveň jednoduchých 1:1 či 1:2 komplexů, což naznačuje vznik vyšších řádů stechiometrie (n:n). Srovnání se simulacemi ukázalo, že modely 1:1 a 1:2 neodpovídají ani maximální Mw ani pozici maxima v závislosti na složení.
Model ISA poskytl základní popis řetězení [(SA)(Ab)]n s Kd,1:1 = 5 nM a Kd,ISA = 44 nM, ale ignoroval jiné stoichiometrie. Doplněný model ISA+1:2+2:1 sjednotil Kd pro všechny termíny kolem 23 ± 7 nM a ukázal významné přispění komplexů (SA)(Ab)2 a (SA)2(Ab). Nejlepším popisem se ukázal „2×2“ model, zahrnující všechny n:n, n:n–1 i n–1:n komplexy bez kooperativity, s jednou konstantou Kd = 34 nM na vazebné místo (χ2 = 0,19).

Přínosy a praktické využití metody

CG-MALS nabízí unikátní schopnost stanovit absolutní stechiometrii a afinitu multivalentních interakcí v roztoku bez artefaktů povrchové imobilizace. To je klíčové pro přesnou charakterizaci protein-protein vazeb, vývoj biologických léčiv, validaci QA/QC procesů a výzkum složitých biologických systémů.

Budoucí trendy a možnosti využití

CG-MALS lze rozšířit na analýzu dalších multivalentních systémů, včetně aptamerů, nukleových kyselin nebo polyvalentních ligandů. Budoucí integrace s mikrofluidikou, vysokou propustností a kombinací s dalšími detekčními metodami (např. fluorescence, SPR) umožní detailnější popis kinetiky, termodynamiky a dynamiky složitých biomolekulárních sítí.

Závěr

Studie prokázala, že CG-MALS v kombinaci s vhodnými matematickými modely dokáže přesně odhalit složení, stechiometrii a afinitu multivalentních makromolekulárních komplexů v roztoku. Model „2×2“ byl optimální pro popis SA-Ab systému, kdy každá molekula vystavuje dvě ekvivalentní vazebné místo, a potvrdil vznik komplexů řádu n:n bez kooperativity.

Reference

1. Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M. & Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. PNAS 90, 5076–5080 (1993).
2. Ruigrok, V. J. B. et al. Kinetic and stoichiometric characterisation of streptavidin-binding aptamers. Chembiochem 13, 829–836 (2012).
3. Some, D. Light-scattering-based analysis of biomolecular interactions. Biophys Rev 5, 147–158 (2013).
4. Some, D. & Kenrick, S. Characterization of Protein-Protein Interactions via Static and Dynamic Light Scattering. Protein Interactions (2012).
5. Binding Affinity and Stoichiometry of a Multivalent Protein-aptamer Association. Wyatt Technology Corp. (2012).