Fusion protein complexes analyzed by CG-MALS—non-equivalent, multivalent interactions

Význam tématu

Komplexní interakce mezi biomolekulami s více místy vázání hrají klíčovou roli v biologických procesech i ve vývoji léčiv a biotechnologií. Stanovení afinity a stechiometrie těchto interakcí je však náročné, zejména pokud mohou vznikat různé komplexní formy. Kompozičně gradientní vícipoziční rozptyl světla (CG-MALS) umožňuje přímé měření afinity a absolutní stechiometrie v roztoku bez potřeby imobilizace či značení molekul.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem studie bylo demonstrovat schopnost CG-MALS při kvantifikaci interakce mezi fúzním proteinem Y se dvěma nezávislými vazebnými místy a jeho ligandem X. Pomocí dvou experimentů CG-MALS byly určeny disociační konstanty obou vazebných míst a potvrzena přítomnost komplexu se stoichiometrií 2:1. Výsledky byly porovnány s dříve publikovanými daty získanými metodami SPR, ITC a analytickou ultracentrifugací.

Použitá metodika

Experimenty byly navrženy pomocí simulačního nástroje softwaru CALYPSO, který pomohl zvolit vhodné koncentrační rozpětí pro stanovení Kd v rozsahu od 10 nM do desítek mikromolár. První měření proběhlo při nízkých koncentracích (přibližně 0,8 µM X a 4,8 µM Y) s třemi typy gradientů: samostatný gradient Y, heteroasociační crossover gradient a samostatný gradient X. Druhý experiment byl zaměřen na vyšší koncentrace (přibližně 30 µM X a 3 µM Y) s heteroasociačním gradientem, aby se přesně vyčíslila slabší vazba.

Použitá instrumentace

• Wyatt Calypso – automatizace CG-MALS
• DAWN MALS detector – vícipoziční rozptyl světla
• UV/Vis detektor (Waters) pro koncentrace
• Inline filtry 0,02 µm, bufferový systém s peristaltickým čerpadlem

Hlavní výsledky a diskuse

První experiment potvrdil vysokou afinitu prvního vazebného místa (Kd přibližně 10 nM) a naznačil existenci druhého slabšího místa (Kd vyšší než 10 µM). Analýza závislosti měrné hmotnosti na koncentraci vyloučila samovolnou oligomerizaci samostatných proteinů X a Y. Druhý experiment při vyšších koncentracích potvrdil přítomnost komplexu X2Y a upřesnil Kd druhé vazby na přibližně 14 µM. Celkové výsledky plně korespondují s hodnotami získanými technikami ITC a analytickou ultracentrifugací, přičemž CG-MALS nepodléhá artefaktům povrchové imobilizace jako SPR.

Přínosy a praktické využití metody

CG-MALS umožňuje:

• přímé stanovení molární hmotnosti a stechiometrie komplexů v roztoku
• měření více vazebných míst nezávisle
• rychlé experimenty trvající 1–2 hodiny
• vyhnutí se artefaktům povrchové imobilizace či značení

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj CG-MALS by mohl zahrnovat analýzu složitějších multivalentních systémů, integraci s kinetickými modely a využití simulačního softwaru pro optimalizaci experimentálních podmínek. Metoda má potenciál pro vývoj nových biologických léčiv, charakterizaci protilátek i studií receptor-ligand interakcí v průmyslové analytice a kvalitativní kontrole.

Závěr

CG-MALS představuje robustní a univerzální nástroj pro kvantifikaci afinity a stechiometrie multivalentních interakcí. Představená studie demonstrovala přesné stanovení dvou vazebných konstant fúzního proteinu a ligandu, přičemž výsledky odpovídají metodám ITC a AUC a výrazně překonávají časovou náročnost těchto technik.

Reference

1. Yamniuk A. P. et al. Background for the Molecular Interactions Research Group (MIRG) 2012 Benchmark Study. ABRF 2013.
2. Yadav S. P. et al. Molecular Interactions Research Group (MIRG) 2012 Benchmark Study Results. ABRF 2013.
3. Yamniuk A. P. et al. Development of a Model Protein Interaction Pair as a Benchmarking Tool for the Quantitative Analysis of 2-Site Protein-Protein Interactions. J. Biomol. Tech. 26, 125–141 (2015).