Peptide Mapping of Tryptic Digests for mAbs using a novel ECD cell on the 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Mapování peptidů po tryptickém štěpení monoklonálních protilátek je klíčové pro charakterizaci post-translačních modifikací, zejména glykozylace, která zásadně ovlivňuje stabilitu, účinnost a bezpečnost terapeutických mAb.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje využití nového ExD (elektronově řízeného štěpení) buněčného modulu na přístroji Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF pro zachování labilech glykanů při MS/MS analýze. Srovnává tuto metodu s klasickým CID (collision-induced dissociation) na modelových vzorcích NIST mAb a trastuzumabu.

Použitá metodika a instrumentace

Digestion protokol:

• AssayMAP Bravo system: in-solution a SP3 (single-pot) tryptické štěpení
• Rekonsitituce peptidů v 0,1 % HCOOH (0,5 µg/µL)

LC podmínky:

• Agilent 1290 Infinity II LC s G7167B multisampler (6 °C)
• Kolona 40 °C, průtok 0,3 mL/min, injekce 6 µL
• Solvent A: voda + 0,1 % FA; Solvent B: ACN + 0,1 % FA; gradient 2–40 % B (0–90 min), promývání 80 % B (90,5–94 min)

MS podmínky:

• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s ExD celou
• MassHunter BioConfirm 12.1
• Rozsah m/z 100–3000, 3 spektra/s; režim Extended Dynamic Range (2 GHz)
• Teplota plynu 250 °C, drying gas 10 L/min, nebulizér 25 psi, Vcap 3500 V, fragmentor 170 V

Hlavní výsledky a diskuse

Ve výchozím chromatogramu glykopeptidy tvoří méně než 10 % signálu základní špičky, přesto ExD mod ukázal:

• Seq. pokrytí ~99 % pro NIST i trastuzumab
• C-typové (s intactním glykánem i bez něj) a z-typové fragmenty s jasným rozlišením glykovaných a deglykovaných iontů
• CID režim generuje téměř výlučně glykanový fragment HexNAc (m/z 204,086) s minimem backbone fragmentů

Přínosy a praktické využití metody

ExD buněčný modul výrazně zlepšuje analýzu labilech modifikací tím, že zachová intactní glykany na peptidovém skeletu, což dovoluje:

• Komplexní charakterizaci glykopeptidů u výrobních i kontrolních procesů mAb
• Zvýšení spolehlivosti a reprodukovatelnosti v QA/QC laboratořích
• Podporu rychlejšího vývoje biosimilars a terapeutických protilátek

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření elektronově řízených štěpení v klinické a bioprodukční analytice, včetně:

• Automatizovaných workflow pro vysokokapacitní screening PTM
• Integrace s iontovou mobilitou a dalšími pokročilými rozdělovacími technikami
• Optimalizace softwaru pro detailní mapování modifikací a kvantifikaci glykokoček

Závěr

Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s ExD buněčkou přináší robustní přístup k detailnímu mapování glykopeptidů u monoklonálních protilátek s vynikajícím pokrytím sekvence a zachováním intactních glykánů, čímž překonává limitace CID metod.

Reference

• Zheng K, Bantog C, Bayer R. The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. MAbs. 2011;3(6):568–576.