Glycopeptide Characterization for Various Monoclonal Antibodies Using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Význam tématu

Monoklonální protilátky a jejich deriváty patří mezi klíčové bioterapeutické molekuly s širokým použitím v medicíně. Proteinová glykosylace představuje jednu z nejvýznamnějších posttranslačních modifikací ovlivňujících biologickou aktivitu, imunogenicitu a stabilitu mAb. Detailní charakterizace glykanových forem je nezbytná pro zajištění kvality a účinnosti biofarmaceutik.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje optimalizovaný LC/MS pracovní postup (úroveň 3) pro analýzu glykopeptidů z monoklonálních protilátek. Využívá Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF v kombinaci s automatizovaným vzorkovým zpracováním a softwarovou platformou pro identifikaci a relativní kvantifikaci glykokonjugátů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky tří mAb (NISTmAb, Herceptin, CHO mAb1) byly redukovány, alkylovány a tráveny směsí Trypsin/Lys-C na platformě Agilent AssayMAP Bravo. Roztoky glykopeptidů byly separovány v reverzní fázi (RP-C18) a v HILIC (AdvanceBio Glycan Mapping) kolonně na LC systému Agilent 1290 Infinity II. Detekce proběhla na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Agilent Jet Stream zdrojem. Data byla zpracována v MassHunter BioConfirm 10.0 s funkcí Peptide Feature Extraction pro automatickou identifikaci a kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

HILIC kolona významně zlepšila retenci a rozlišení glykopeptidů oproti RP-C18, kde se glykokonjugáty elutovaly v úzkém čase na začátku gradientu. Šest nejabundantnějších glycopeptidů z místa N-glykozylace HC N300 bylo spolehlivě odděleno a kvantifikováno s vysokou reprodukovatelností (SD < 0,2 %). Porovnání tří mAb ukázalo rozdíly v distribuci G0F, G1F a G2F forem – např. Herceptin vykazoval vysoký podíl G0F (> 65 %), zatímco NISTmAb měl téměř vyrovnané G0F a G1F (~ 40 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přesná identifikace glykopeptidů v rámci běžného peptide mappingu.
• Detailní kvantitativní profilování nejčastějších glykoform.
• Informace o lokalizaci N-glykozylace v peptidové sekvenci.
• Vysoká automatizace vzorkového zpracování a analýzy usnadňuje standardizaci QC procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace umělé inteligence a pokročilé bioinformatiky pro rychlejší de novo identifikaci a predikci funkcí glykanů. Vývoj nových HILIC materiálů a kolaborace s multi-omics přístupy umožní hlubší porozumění struktuře a variability bioterapeutik. Vzrůstající tlak regulací povede k přísnější kvalitativní kontrole a validaci glykopeptidových metod.

Závěr

Popsaný LC/MS workflow s HILIC separací a automatizovaným zpracováním poskytuje robustní nástroj pro komplexní glykopeptidovou analýzu monoklonálních protilátek. Metoda kombinuje vysokou citlivost, rozlišení a reprodukovatelnost, což zrychlí vývoj i rutinní kontrolu biopharmaceutik.

Reference

1. Rademacher TW, Williams P, Dwek RA. Agalactosyl glycoforms of IgG autoantibodies are pathogenic. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:6123–6127.
2. Precise Characterization of Intact Monoclonal Antibodies by the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Agilent Technologies; 5991-7813EN.
3. Making Peptide Mapping Routine with the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Agilent Technologies; 5991-7815EN.
4. Dong Q et al. In-Depth Characterization and Spectral Library Building of Glycopeptides in the Tryptic Digest of a Monoclonal Antibody Using 1D and 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 2016;15:1472–1486.
5. A Comprehensive Approach for Monoclonal Antibody N-linked Glycan Analysis from Sample Preparation to Data Analysis. Agilent Technologies; 5991-8550EN.
6. Automation for LC/MS Sample Preparation High Throughput In-Solution Digestion and Peptide Cleanup Enabled by the Agilent AssayMAP Bravo Platform. Agilent Technologies; 5991-2957EN.
7. Highly Confident Peptide Mapping of Protein Digests Using Agilent LC/QTOFs. Agilent Technologies; 5991-8552EN.