Evaluation binding of individual and combined domains in the bacterial flagellar motor complex by CG-MALS

Význam tématu

Regulace směru otáčení bakteriálních bičíků je klíčová pro bakteriální chemotaxi a pohyb. Střídání konformačních stavů komplexu FliG–FliM umožňuje změnu rotace z protisměrné na souosou. Porozumění afinitám a stoichiometriím těchto protein–protein interakcí je základem pro vysvětlení mechanismu spouštěcího přepínače bičíku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo potvrdit a kvantifikovat interakce jednotlivých domén proteinu FliG (střední doména FliG_M a C-terminální doména FliG_C) s partnerem FliM a zjistit chování kompletní více-doménové formy FliG_MC. K tomuto účelu byla rozšířena dřívější NMR měření o techniku kompozičně-gradientní multiúhlové statické rozptylové světlo (CG-MALS).

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu různých poměrů proteinů a pufrů byla použita automatizovaná aparatura Calypso® s online DAWN® MALS detektorem. Vzorky byly filtrovány Anotop stříkačkovými filtry (0,02 a 0,1 µm). Koncentrace byla určována UV spektroskopií. Data sběru a analýzy bylo řízeno softwarem CALYPSO™.

Hlavní výsledky a diskuse

1) FliG_M vykázala silné spojení s FliM s K_d=6,6 µM a 1:1 stoichiometrií. Výsledky odpovídají dřívějším odhadům 1–10 µM.
2) FliG_C prokázala slabou vazbu s FliM (K_d=580 µM) a 1:1 komplexy, ve shodě s předchozími NMR daty (~200 µM).
3) Více-doménový FliG_MC se choval odlišně: interakce s FliM probíhala pomalu, kinetika nedosáhla rovnováhy ani po hodině. Analyzované mezistavy naznačují vznik komplexů s poměrem FliM:FliG až 3:2 a vyššími molekulovými hmotnostmi (~230 kDa), což naznačuje postupnou oligomerizaci nad rámec jednoduché 1:1 vazby.

Přínosy a praktické využití metody

CG-MALS umožňuje přesné stanovení afinit, stoichiometrií i kinetiky složitých proteinových interakcí v roztoku, což není možné pomocí povrchových technik (SPR) ani tradičních řešení (ITC, sedimentační analýza). Tato metoda je vhodná pro výzkum složitých biomolekulárních systémů, kde dochází k pomalé a postupné samo-sdružení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření CG-MALS na studium dalších bakteriálních motility komponent a regulačních proteinů.
• Sledování vlivu chaperonů či lokálních koncentrací v mimobuněčném prostředí.
• Integrace s dalšími biofyzikálními metodami (SAXS, cryo-EM) pro detailní strukturální modelování.

Závěr

CG-MALS odhalila významné rozdíly v afinitách domén FliG k FliM, potvrdila mechanistickou roli FliG_M v přepínači bičíku a ilustrativně zachytila pomalou oligomerizaci více-doménových komplexů. Tyto poznatky přispívají k hlubšímu porozumění sebe-sestavování flagelárního motoru.

Reference

1. Dyer C.M. et al., J. Mol. Biol. 388, 71–85 (2009).
2. Blair D.F., J. Bacteriol. 188, 7033–7045 (2006).
3. Park S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 11886–11891 (2006).
4. PDB: FliG 1LKV; FliM 2HP7.