EC-MALS for absolute biophysical characterization

Význam tématu

Precizní biofyzikální charakterizace biomakromolekul v roztoku je zásadní pro vývoj léčiv i základní výzkum. Měření molární hmotnosti, velikosti a oligomerního stavu pomáhá ověřit čistotu, stabilitu a funkčnost proteinů, peptidů i nukleových kyselin. Tradiční metody jako SDS-PAGE, analytická ultracentrifugace nebo SEC s kalibračními křivkami mají limity, které odstraní přidání detektorů pro multi-úhlový rozptyl světla a doplňkových detektorů UV a RI.

Cíle a přehled studie

Cílem je představit komplexní řešení párování size-exclusion chromatography (SEC) s multi-úhlovým rozptylem světla (MALS), UV a RI detektory k absolutnímu stanovení molární hmotnosti, velikosti a oligomerního stavu bez nutnosti kalibrace referenčními standardy. Článek shrnuje klíčové komponenty metody, jejich vlastnosti a typické aplikace v biotechnologii a farmaceutickém vývoji.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda SEC-MALS využívá:

• Vysoce kvalitní SEC chromatograf (HPLC, UHPLC, FPLC) pro separaci na základě hydrodynamického velikosti
• MALS detektory DAWN (18 úhlů), miniDAWN a microDAWN (3 úhly) pokrývající rozsah molárních hmotností od stovek Daltonů po gigadaltony
• dRI detektory Optilab a microOptilab pro robustní kvantifikaci koncentrace na základě změny refrakčního indexu
• DLS moduly WyattQELS nebo DynaPro pro měření hydrodynamického poloměru od 0,5 nm
• Softwarové prostředí ASTRA pro synchronizovanou akvizici, zpracování dat a pokročilé analýzy včetně vypočtu molární hmotnosti, velikosti, distribucí i konjugátové analýzy

Hlavní výsledky a diskuse

Ukázky aplikací demonstrují:

• Určení oligomerního stavu a přesné molární hmotnosti proteinů a jejich agregátů
• Detekci a kvantifikaci nízkomolekulových fragmentů a konjugátů mAb
• Stanovení absolutní stechiometrie protein-protein a protein-nukleová kyselina komplexů
• Kompozitní analýzu konjugovaných proteinů (PEGylace, glykosylace, ADC) s výpočtem množství modifikující složky
• Charakterizaci detergentem solubilizovaných membránových proteinů a volbu podmínek udržujících jejich funkční oligomer

Přínosy a praktické využití metody

SEC-MALS poskytuje jedinou univerzální metodu pro absolutní stanovení molární hmotnosti a velikosti biomolekul v roztoku bez závislosti na referenčních standardech. Metoda zvyšuje spolehlivost QC v biotechnologických procesech a umožňuje detailní vhled do struktury a interakcí bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření kombinace SEC-MALS s dalšími separačními technikami jako AF4, vývoj MALS detektorů pro rychlé UHPLC vrcholy, automatizované CG-MALS pro ředicí gradienty a nové analýzy nanočástic a komplexních heterokomplexů.

Závěr

Kombinace SEC s MALS, UV, RI a DLS detektory se etablovala jako klíčová metoda pro absolutní biofyzikální charakterizaci biomakromolekul v roztoku. Její univerzálnost, citlivost a nezávislost na standardech ji předurčují k širokému využití v biotechnologii a farmaceutickém výzkumu.

Reference

Obsáhlý seznam literatury a aplikačních poznámek na webu Wyatt Technology pokrývá stovky publikací demonstrujících úspěšné aplikace SEC-MALS v proteinové chemii, vývoji bioterapeutik a analýze nanomateriálů