Mouse fatty liver proteomes in dda-PASEF and dia-PASEF from low input using the timsTOF SCP

Význam tématu

V posledních letech narůstá incidence nealkoholických tukových onemocnění jater způsobených zejména špatnou životosprávou. Identifikace spolehlivých biomarkerů a možnost testovat potenciální léčiva vyžaduje citlivé proteomické metody, které dokážou analyzovat velmi malé množství vzorku. Pokročilé techniky založené na LC MS/MS přístroji timsTOF SCP s PASEF akvizicí umožňují hluboké proniknutí do proteomu játra i při nanogramových vstupech.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat výkonnost DDA-PASEF a DIA-PASEF akvizice u proteomů myších jater získaných z modelu s vysokotučnou dietou a genetickou modifikací. Autoři sledovali reproducibilitu, počet identifikovaných proteinových skupin a hloubku pokrytí proteomu při použití pouhých 10 ng (DDA) a 1 ng (DIA) na kolonu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala následující kroky:

• Příprava tkáně: sklizení a rychlé zmrazení jater z myší na západní dietě s přetížením tukem.
• Extrahování proteinu: redukce, alkylace a tryptická štěpení získaného materiálu s následným čištěním na STRAP sloupcích.
• Chromatografie: nanoElute systém s Aurora nano C18 kolonkou (25 cm × 75 µm, 400 nl/min, gradient 90 min).
• Hmotnostní spektrometrie: timsTOF SCP provozovaný v módech dda-PASEF a dia-PASEF.
• Bioinformatická analýza: DDA data zpracována v PEAKS OnLine, DIA data v Spectronaut 17 při 1 % FDR.

Instrumentace:

• Bruker NanoElute
• timsTOF SCP (Bruker Daltonics)
• Aurora nano C18 kolona (IonOpticks)
• Software PEAKS OnLine a Spectronaut 17

Hlavní výsledky a diskuse

V režimu dda-PASEF s 10 ng vzorku bylo průměrně identifikováno přes 5 000 proteinových skupin a 41 000 peptidů s technickou opakovatelností nad 38 %. U dia-PASEF s pouhým 1 ng materiálu bylo dosaženo více než 4 500 proteinových skupin, 45 000 sekvencí a 50 000 peptidů u tukové jater a nad 5 500 proteinových skupin v kontrolních vzorcích. Nezávislá hierarchická klastrová analýza dia-PASEF dat jasně oddělila vzorky divokého typu od tukového modelu. Ion cloud coverage a base peak chromatogramy potvrdily vysokou citlivost a selektivitu metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje velmi hlubokou analýzu proteomu z velmi omezeného množství tkáně, což otevírá cesty k:

• Studii proteomických změn v mikrodisekovaných oblastech tkáně.
• Testování nových terapeutik v preklinických modelech s minimálním odběrem materiálu.
• Objevování biomarkerů pro časnou diagnostiku jaterních onemocnění.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj metodiky by mohl zahrnovat integraci s imaging proteomikou, rozšíření spektrálních knihoven pro více modelů a mikroděrkové odběry, přechod k single-cell proteomice a standardizaci workflow pro klinické aplikace. Kombinace PASEF akvizice s AI poháněnou analýzou dat přinese vyšší automatizaci a rychlejší interpretaci výsledků.

Závěr

Studie prokázala, že timsTOF SCP s PASEF akvizicí poskytuje výjimečnou citlivost a reprodukovatelnost pro analýzu myšího jaterního proteomu z subnanogramových vstupů. Metoda je slibná pro preklinická onkologická a metabolická výzkumná centra, která vyžadují detailní proteomický profil s omezeným množstvím vzorku.