Pushing the boundaries for robust and high-throughput single cell analysis with Whisper Flow Technology powered by dia-PASEF

Význam tématu

Analýza proteomu na úrovni jednotlivých buněk otevírá nové možnosti v biologickém a klinickém výzkumu, zejména pro odhalení heterogenity buněčných populací. Díky vysoké citlivosti a reprodukovatelnosti lze identifikovat stovky až tisíce proteinů z jediného média buňky, což je klíčové pro studium buněčných mechanismů, biomarkerů a odpovědí na léčbu.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují integrovaný pracovní postup pro vysoce robustní a škálovatelnou analýzu proteomu jednotlivých buněk. Cílem je zvýšit počet identifikovaných proteinů, zkrátit dobu analýzy a zároveň minimalizovat chyby spojené s manuální manipulací vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Pracovní postup kombinuje následující principy a zařízení:

• Řazení a popisování buněk na prototypovém čipu (proteoCHIP od Cellenion) s následnou centrifugační transferací do Evotips (Evosep Biosystems).
• Chromatografie na kapalinovém chromatografu Evosep s kolónami Aurora Elite a Aurora Rapid (IonOpticks) při průtoku 100 nl/min.
• Hmotnostní spektrometrie Bruker timsTOF SCP s režimem dia-PASEF.
• Softwarová analýza dat v DIA-NN (verze 1.8.1) využívající jak předpovězenou knihovnu (Swiss-Prot), tak i knihovnu z DDA experimentu.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie demonstrovala:

• Průměrnou identifikaci ~3 500 proteinových skupin na jednu buňku HeLa metodou Whisper 40 SPD. Celkově bylo detekováno až 5 500 proteinů v datasetu.
• Vysokou reprodukovatelnost – přímý centrifugační transfer do Evotips vykázal užší rozptyl počtu identifikovaných prekursorů než manuální pipetovací přenos.
• Stabilitu vzorků – Evotips uloženy při laboratorní teplotě až 2,5 dne bez znatelného úbytku proteomické hloubky.
• Škálovatelnost – s metodou Whisper 80 SPD bylo analyzováno až 80 jednobuněčných vzorků za den s průměrnou identifikací ~1 400 proteinů na buňku A549.
• Analýzu velikostně odlišených skupin buněk (18–30 µm) – PCA a ANOVA odhalily >2 500 proteinů diferencovaně regulovaných podle velikosti buňky.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený workflow přináší:

• Bezpipetovou manipulaci se vzorky, která minimalizuje ztráty a zvyšuje reprodukovatelnost.
• Vysokou denzitu analýz (až 80 buněk/den) vhodnou pro velké experimentální kohorty.
• Možnost dlouhodobého skladování připravených Evotips bez dopadu na kvalitu dat.
• Flexibilitu pro různé typy buněk a rozsahy proteinového materiálu od pg až po ng měřené látky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Zaměření do budoucna bude směřovat k:

• Další integraci mikrofluidních platforem pro plně automatizovaný „bench-to-data“ postup.
• Vývoji rychlejších a citlivějších kolón, které umožní ještě vyšší propustnost.
• Implementaci pokročilých AI/ML nástrojů pro zpracování a interpretaci dat z jednobuněčných proteomických měření.
• Rozšíření aplikací do klinické diagnostiky a personalizované medicíny, kde jednotlivé biomarkery odhalí detaily patologických stavů.

Závěr

Whisper Flow Technology v kombinaci s dia-PASEF na timsTOF SCP představuje robustní a vysoce výkonnou platformu pro jednobuněčnou proteomiku. Metoda dosahuje vysokého počtu identifikací, vynikající reprodukovatelnosti a škálovatelnosti, což otevírá nové možnosti pro rozsáhlé biologické a klinické studie.

Reference

1. Bekker-Jensen DB, Krisp C, Hartlmayr D, Seth A, Hørning OB, Huusfeldt M, Almeida A, Lubeck M, Kruppa G, Sandow J, Bache N. Pushing the boundaries for robust and high-throughput single cell analysis with Whisper Flow Technology powered by dia-PASEF. Evosep Biosystems; 2023.