Proteomic changes in tissue samples of mouse gastric carcinoma: Label-free quantitation on the timsTOF fleX with PASEF

Význam tématu

Proteomická analýza tkáňových vzorků žaludečního karcinomu u myší poskytuje hluboký vhled do biochemických a molekulárních mechanismů karcinogeneze. Label-free kvantifikace proteinů umožňuje identifikovat rozdíly v expresi bez nutnosti drahých značení, což je zásadní pro objev biomarkerů a cílených terapií při omezeném množství biologického materiálu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat proteomické profily nádorové (T) a nenádorové (NT) tkáně žaludku ze stejného myšího modelu (CEA424‐SV40 Tag C57BL/6J) s referencí divokého typu (WT). Použitím technologie PASEF na hmotnostním spektrometru timsTOF fleX s 90minutovou gradientní separací se sledovala identifikace, kvantifikace a biologická relevance detekovaných proteinových skupin.

Použitá metodika

• Příprava vzorků: Kryosekce zmrazených tkání, lyze a tryptická digestace.
• Chromatografie: NanoUHPLC s C18 kolonkou (25 cm × 75 μm, 1,6 μm, IonOpticks) s lineárním gradientem 6–35 % organické fáze B (0,1 % FA v ACN) při 400 nL/min.
• Datová akvizice: PASEF režim se scanovacími cykly 1,1 s zahrnujícími 1 MS a 10 MS/MS PASEF skenů.
• Data processing: MaxQuant s Andromeda engine, nastavení pro trypsin, Carbidomethyl (C) fixní modifikace, oxidace (M) a acetylace (N-terminus) variabilní, výběr Match-between-runs a Limma statistika pro diferenciální expresi.

Použitá instrumentace

• Hmotnostní spektrometr: Bruker timsTOF fleX s PASEF.
• Ionizační zdroj: CaptiveSpray.
• HPLC systém: nanoElute UHPLC (Bruker Daltonics).
• Kolonka: C18 (IonOpticks, 25 cm × 75 μm, 1,6 μm).

Hlavní výsledky a diskuse

• Bylo identifikováno 5001 proteinových skupin, z toho 2330 detekovaných v všech 27 vzorcích (50% datové kompletnosti).
• Průměrně 3652 proteinů na vzorek (±225) s vynikající technickou reprodutibilitou (R2 > 0,98).
• PCA rozlišení skupin WT, NT a T s PC1 29,2 % a PC2 10,3 % variace.
• Diferenciální analýza odhalila 110 signifikantně regulovaných proteinů (|FC| > 1,5, p < 0,05) mezi T a NT.
• GO analýza (STRING) prokázala významné obohacení minichromozomálního udržovacího komplexu (MCM) v nádorové tkáni (FDR < 1e-8), což koreluje s aktivovanou replikací DNA a proliferací buněk.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda PASEF na timsTOF fleX poskytuje vysokou citlivost, robustní reprodutibilitu a nízké požadavky na vstupní množství proteinu (240 ng). Díky tomu je vhodná pro klinicky relevantní vzorky v laboratořích QA/QC, farmaceutickém výzkumu i základní vědě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace s prostorovou proteomikou, vyšší throughput pomocí ultrarychlého LC, využití umělé inteligence pro analýzu čtyřrozměrných dat a multi-omics přístupy podpoří objev nových biomarkerů a personalizovaných léčebných strategií.

Závěr

Label-free kvantifikace na timsTOF fleX s PASEF umožňuje komplexní, citlivé a vysoce reprodutabilní proteomické studie malých tkáňových vzorků. Studie demonstruje obohacení MCM-komplexu v myším žaludečním karcinomu a potvrzuje vhodnost technologie pro biomarker discovery a klinický výzkum.

Reference

• Meier F et al. J Proteome Res. 2015; PMID:26538118
• Thompson J et al. Int. J. Cancer. 2000; PMID:10842202
• Hinsenkamp I et al. Neoplasia. 2016; PMID:27566106
• Erich K et al. Mol Cell Proteomics. 2018; doi:mcp.RA118.000980
• Ritchie M et al. Nucleic Acids Res. 2015; doi:10.1093/nar/gkv007