Evaluation and application of salt- and pH-based ion-exchange chromatography gradients for analysis of therapeutic monoclonal antibodies

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčovou třídu terapeutických proteinů s vysokou specificitou k antigenům. Během bioprocesingu a skladování dochází k enzymatickým i neenzymatickým modifikacím, které mění izoelektrický bod a nábojovou heterogenitu molekul. Kontrola a kvantifikace těchto nabitých variant je zásadní pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti léčiv, a proto se iontoměničová chromatografie (IEX) stala standardní metodou pro analýzu kritických kvalitatativních parametrů mAb.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat tradiční solné IEX gradienty s novou pH gradientní platformou CX-1 pro stanovení nabitých variant terapeutických mAb. Autoři sledovali snadnost přípravy, reproducibilitu napříč různými přípravami pufrů a rychlost optimalizace metody. Aplikace metody byla demonstrována na čtyřech komerčních mAb: bevacizumabu, cetuximabu, infliximabu a trastuzumabu.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava pufrů: solné gradienty založené na 20 mM fosfátových a MES pufrech s různou koncentrací NaCl; pH gradienty generované buď čtyřkomponentním mícháním (kyselina, báze, sůl, voda) nebo Thermo Scientific CX-1 pH buffer platformou (Buffer A pH 5.6, Buffer B pH 10.2).
• Chromatografie: lineární gradient z 0 na 100 % pH bufferu B během 30 min pro většinu testovaných mAb; úprava pH rozsahu a gradientního profilu pro každou protilátku (optimalizace < 1,5 h).
• Příprava vzorků: přímá injekce mAb v jejich farmaceutickém formulátovacím pufru; pro identifikaci C‐terminálních lyzinových variant 2hodinová inkubace s carboxypeptidázou B (15 U na 200 µg mAb) při 37 °C.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Flex Quaternary UHPLC systém (Quaternary Pump F, Column Compartment H, Split Sampler FT, Diode Array Detector HT s LightPipe 10 mm buňkou).
• MAbPac SCX-10 kolona 4 × 250 mm, 10 µm pro separaci mAb nabitých variant.
• Thermo Scientific CX-1 pH Gradient Buffer A (pH 5.6) a Buffer B (pH 10.2).
• Thermo Scientific Chromeleon Chromatography Data System 7.2.4 pro akvizici a analýzu dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Příprava solných pufrů vykazovala mezi různými analytiky a dny větší posuny retencí, především u fosfátových systémů. MES pufry byly o něco stabilnější, nejvyšší reprodukovatelnost však prokázaly pH gradientní CX-1 pufry.
• pH gradient umožnil rozlišení až 12 nabitých variant mAb versus 10 špiček u solných gradientů, s lepšími hodnotami rozlišení a kapacity sloupce.
• Optimalizace pH gradientu pro každý mAb proběhla rychle (< 1,5 h), což výrazně zkracuje časový rámec vývoje metody ve srovnání s úpravou solných gradientů.
• Digesce carboxypeptidázou B odstranila základní špičky odpovídající C‐terminálním lyzinovým variantám u bevacizumabu, cetuximabu a infliximabu. Trastuzumab neobsahoval detekovatelné C‐koncové lyzinové formy.

Přínosy a praktické využití metody

pH gradientní IEX na platformě CX-1 v kombinaci se sloupcem MAbPac SCX-10 a Vanquish Flex UHPLC nabízí rychlý, reprodukovatelný a univerzální přístup k analýze nabitých variant mAb. Metoda je vhodná pro preklinický vývoj, vývoj procesů i rutinní QA/QC analýzy biosimilars i originálních terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření pH bufferů pro pokrytí mAb s izoelektrickým bodem mimo rozsah pH 6–10.
• Integrace IEX s hmotnostní spektrometrií pro přímou identifikaci modifikací v chromatografických frakcích.
• Automatizace přípravy gradientů a zpracování dat v rámci pokročilých chromatografických datových systémů.

Závěr

Thermo Scientific CX-1 pH gradientní pufry spolu s MAbPac SCX-10 sloupcem a Vanquish Flex UHPLC poskytují robustní, snadno optimalizovatelnou a vysoce reprodukovatelnou platformu pro analýzu náboje mAb. Tato metoda zkracuje čas vývoje, zvyšuje rozlišení nabitých variant a minimalizuje variabilitu spojenou s přípravou solných gradientů.

Reference

1. Berkowitz SA et al. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nat Rev Drug Discov. 2012;11(7):527–540.
2. Khawli LA et al. Charge variants in IgG1: Isolation, characterization, in vitro binding properties and pharmacokinetics in rats. MAbs. 2010;2(6):613–624.
3. Rathore AS. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends Biotechnol. 2009;27(9):546–553.
4. Zheng JY, Janis LJ. Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298. Int J Pharm. 2006;308(1-2):46–51.
5. Huang L et al. In vivo deamidation characterization of monoclonal antibody by LC/MS/MS. Anal Chem. 2005;77(5):1432–1439.
6. Antes B et al. Analysis of lysine clipping of a humanized Lewis-Y specific IgG antibody and its relation to Fc-mediated effector function. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;852(1-2):250–256.
7. Liu H et al. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J Pharm Sci. 2008;97(7):2426–2447.
8. Parr MK, Montacir O, Montacir H. Physicochemical characterization of biopharmaceuticals. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2016;.
9. Farnan D, Moreno GT. Multiproduct high-resolution monoclonal antibody charge variant separations by pH gradient ion-exchange chromatography. Anal Chem. 2009;81(21):8846–8857.
10. Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks 2014. Nat Biotechnol. 2014;32(10):992–1000.
11. Dick LW Jr et al. C-terminal lysine variants in fully human monoclonal antibodies: investigation of test methods and possible causes. Biotechnol Bioeng. 2008;100(6):1132–1143.