Simple charge variant profile comparison of an innovator monoclonal antibody and a biosimilar candidate

Význam tématu

Cílená analýza variant náboje u monoklonálních protilátek je klíčová pro zajištění kvality, stability a biologické aktivity terapeutických proteinů. U biosimilárních produktů navíc umožňuje ověřit shodu s inovátorem, což je nezbytné pro regulační schválení a udržení konzistentní výroby.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje jednoduchý a reprodukovatelný pracovní postup využívající pH gradientem modulovanou kationtovou výměnnou chromatografii (CEX) ke srovnání profilů nábojových variant cetuximabu – originálního výrobku a biosimilárního kandidáta. Ukazuje rychlou optimalizaci metody a spolehlivou separaci variant.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Flex Quaternary UHPLC
• Kolonová jednotka MAbPac SCX-10 (4 × 250 mm, 10 µm)
• Diode Array Detector HT s LightPipe 10 mm flow cell
• Automatický vzorkovač Split Sampler FT
• pH Gradient Buffer platforma CX-1 (pufry A pH 5,6 a B pH 10,2)

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky cetuximabu (originál i biosimilární) byly naředěny na 5 mg/mL v DI vodě. Část vzorků byla inkubována s karboxypeptidázou B k ověření obsahu C-koncových lysinů. Chromatografie probíhala při 1 mL/min, teplotě kolony 30 °C a detekci při 280 nm. Byly testovány dva lineární pH gradienty („A“: 0–100% B, 0–30 min; „B“: 10–40% B, 0–30 min) připravené 10× ředěním komerčních pufrů.

Hlavní výsledky a diskuse

Shallower gradient B zajistil vyšší rozlišení nábojových variant. U originálního i biosimilárního cetuximabu bylo detekováno deset hlavních špiček, přičemž hlavní izoformu tvořila špička F (6). Rozdíly v profilech se projevily zejména u raných a středních variant (peaks 3, 4 a 9). Retenční časy vykazovaly vysokou přesnost (průměrné RSD 0,14 %; max. 0,65 %). Po ošetření karboxypeptidázou B špičky odpovídající proteoformám s jedním a dvěma C-koncovými lysiny kvantitativně zmizely, čímž se potvrdila jejich identita.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoanalytická platforma pro rychlou porovnávací analýzu biosimilárů
• Minimalizace variability díky komerčně dostupným pufrům a standardní kolony
• Vysoká opakovatelnost retenčních časů usnadňuje QC a identifikaci variant
• Jednoduchá optimalizace gradientu bez nutnosti komplexních změn mobilní fáze

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem v rozvoji jsou integrační přístupy kombinující pH gradientní CEX s hmotnostní spektrometrií pro detailní identifikaci modifikací a automati­zacemi v rámci online QC. Lze také rozšířit použití na jiné třídy biologik a na studie stability během dlouhodobého skladování.

Závěr

pH gradientní CEX na MAbPac SCX-10 v systému Vanquish Flex UHPLC představuje robustní a rychlou metodu pro srovnávací analýzu nábojových variant monoklonálních protilátek. Metoda nabízí vysoké rozlišení, opakovatelnost a snadnou aplikaci v rutině QA/QC a výzkumu.

Reference

1. Beck A.; Wagner-Rousset E.; Ayoub D. a kol. Characterisation of Therapeutic Antibodies and Related Products. Analytical Chemistry 2013, 85, 715–736.
2. Zhang X.; Tang H.; Sun Y.T. Elucidating the effects of arginine and lysine on a monoclonal antibody C-terminal lysine variation in CHO cell cultures. Biotechnology and Bioengineering 2015, 112, 6643–6652.
3. Zhang T.; Bourret J.; Cano T. Isolation and characterization of therapeutic antibody charge variants using cation exchange displacement chromatography. Journal of Chromatography A 2011, 1218, 5079–5086.
4. Teshima G.; Li M.X.; Danishmand R. Separation of oxidized variants of monoclonal antibody by anion-exchange. Journal of Chromatography A 2011, 1218, 2091–2097.
5. Fekete S.; Beck A.; Veuthey J.L. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2015, 113, 43–55.
6. Rea J.C.; Moreno G.T.; Lou Y. Validation of a pH gradient-based ion-exchange chromatography method for high-resolution monoclonal antibody charge variant separations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2011, 54, 317–323.
7. Thermo Scientific Application Note 21788. Evaluation and application of salt and pH-based ion-exchange chromatography gradients for analysis of therapeutic monoclonal antibodies. 2018.