Using the NISTmAb reference standard to demonstrate a simple approach to charge variant analysis

Význam tématu

Charakterizace nábojných variant monoklonálních protilátek je zásadní pro zajištění jejich kvality, stability a bezpečnosti v biotechnologickém i farmaceutickém průmyslu. Variace náboje ovlivňují biologickou aktivitu, imunogenitu a farmakokinetiku léčivého proteinu, a proto vyžadují spolehlivé a reprodukovatelné analytické metody.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat jednoduchý a vysoce replikovatelný postup pro separaci a charakterizaci nábojných variant modelové monoklonální protilátky NISTmAb (RM 8671) pomocí gradientní iontově výměnné chromatografie na principu pH. Studie porovnává nové přístupy s tradičními solnými gradienty a ukazuje vyšší rozlišení variant.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci nábojných variant byl použit systém Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC s kvaternárním čerpadlem a DAD detektorem. Pro silně kationtovou výměnu sloužila kolona MAbPac SCX-10 (4,0 × 250 mm, 10 μm) a pro srovnání ProPac WCX-10 (4,0 × 250 mm, 10 μm). Jako eluenty byly připraveny komerční CX-1 pH gradientní pufry (pH 5,6 a pH 10,2) na bázi fosfátů. K ověření obsahu C-terminálních lyzinů byla protilátka ošetřena exopeptidázou karboxypeptidáza B.

Hlavní výsledky a diskuse

• Gradient pH 5,6→10,2 umožnil rozlišení devíti nábojných variant v časech retence od 14,2 do 18,9 minuty s přesností RSD ≤ 0,25 %.
• Test CPB potvrdil, že tři hlavní špičky odpovídají variantám s 0, 1 a 2 C-term lysiny, poté co špičky s lyzinovými zbytky vymizely.
• V porovnání s klasickou separací na ProPac WCX-10 se solným gradientem bylo dosaženo vyššího rozlišení a identifikace více variant.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou optimalizaci, vynikající reprodukovatelnost a snadnou přípravu pufrů. Lze ji využít jako robustní platformní postup pro vývoj kontrol kvality, srovnávací analýzy originálních i biosimilárních monoklonálních protilátek a podporu dokumentace do žádosti o registraci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení referenčního materiálu NISTmAb v kombinaci s hmotnostní spektrometrií pro detailní identifikaci modifikací na úrovni zbytků. Další vývoj se zaměří na automatizaci přípravy gradientů, nové sorbenty pro vyšší účinnost a začlenění senzorických detektorů pro on-line monitorování výrobních procesů.

Závěr

Studie prokázala, že gradient založený na pH v kombinaci s kolónou MAbPac SCX-10 a Vanquish Flex UHPLC poskytuje rychlou a vysoce rozlišovací analýzu nábojných variant mAb. Tento jednoduchý, ale účinný přístup představuje cenný nástroj pro analytický vývoj, kontrolu kvality i komparabilitu bioterapeutik.

Reference

1. Michels DA, Ip AY, Dillo TM, Brorson K, Lute S, Chavez B, Prentice KM, Brady LJ, Miller KJ. Separation Methods and Orthogonal Techniques. In: State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic mAb Characterization Volume 2. American Chemical Society; 2015. s. 236–284.
2. Zhao YY, Wang N, Liu WH et al. Charge Variants of an Avastin Biosimilar: Isolation, Characterization, In vitro Properties and Pharmacokinetics in Rat. PLoS ONE. 2016;11(3):1–13.
3. Hintersteiner B, Lingg N, Janzek E et al. Microheterogeneity of therapeutic monoclonal antibodies is governed by changes in the surface charge of the protein. Biotechnol J. 2016;11:1617–1627.
4. Zhang T, Bourret J, Cano T. Isolation and characterization of therapeutic antibody charge variants using cation exchange displacement chromatography. J Chromatogr A. 2011;1218:5079–5086.
5. Teshima G, Li MX, Danishmand R et al. Separation of oxidized variants of monoclonal antibody by anion-exchange. J Chromatogr A. 2011;1218:2091–2097.
6. Fekete S, Beck A, Veuthey JL et al. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. J Pharm Biomed Anal. 2015;113:43–55.
7. Khawli LA, Goswami S, Hutchinson R, Kwong ZW, Yang J, Wang X et al. Charge variants in IgG1: Isolation, characterization, in vitro binding properties and pharmacokinetics in rats. mAbs. 2010;2:613–624.
8. Du Y, Walsh A, Ehrick R et al. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. mAbs. 2012;4(5):578–585.
9. Tarlov MJ, Choquette SJ. Reference Material 8671. NIST Report of Investigation. October 2016.