High-Resolution Charge Variant Analysis for Top-Selling Monoclonal Antibody Therapeutics Using a Linear pH Gradient Separation Platform

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují významnou skupinu terapeutik s každoročním objemem prodeje v řádu desítek miliard dolarů. Jejich kvalita a konzistence jsou klíčové jak u originálních léčiv, tak u vznikajících biosimilars. Variace náboje molekul protilátek, způsobené posttranslačními modifikacemi (deamidace, sialylace, odštěpení lyzinu C-koncového konce apod.), patří mezi kritické kvality (CQA) ovlivňující bezpečnost a účinnost přípravků. Vysoce rozlišená analýza těchto variací umožňuje přesnou charakterizaci a kvantifikaci nečistot a strukturálních variant, což je nezbytné pro vývoj a kontrolu biosimilars.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a otestovat univerzální, rychle optimalizovatelnou metodu pro analýzu nábojových variací u čtyř špičkových monoklonálních protilátek – rituximabu (Rituxan), trastuzumabu (Herceptin), adalimumabu (Humira) a bevacizumabu (Avastin) – pomocí lineárního pH gradientu na kolóně MAbPac SCX-10. Výsledky jsou porovnány s konvenčními solnými gradienty, aby bylo ověřeno zlepšení rozlišení a robustnosti metody.

Použitá metodika

Pro separaci variací náboje byla použita lineární pH gradientová chromatografie od pH 5,6 do pH 10,2 na iontoměničové kolóně MAbPac SCX-10 (4×250 mm, 10 μm). Gradient byl tvořen pufrem A (CX-1 pH 5,6) a pufrem B (CX-1 pH 10,2) v poměru 0–100 % B v průběhu 31 min. Pro optimalizaci rozlišení byla testována redukovaná poloosa gradientu (0–50 % B). Pro srovnání byla paralelně provedena analýza pomocí solného gradientu (20 mM MES, 60–300 mM NaCl).

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 BioRS systém
• SRD-3400 Solvent Racks s odvzdušňovačem
• HPG-3400RS biokompatibilní binární pumpa
• WPS-3000TBRS termostatovaný autosampler
• TCC-3000RS termostatovaná kolónová komora
• VWD-3400RS UV detektor (280 nm) se semi-mikro průtokovou kyvetou
• PCM-3000 pH a vodivostní monitor
• Kolóna MAbPac SCX-10, 4×250 mm, 10 μm

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární pH gradient poskytl konzistentní a reprodukovatelný profil změn pH, který pokrývá izoelektrické body většiny terapeutických protilátek. U všech čtyř testovaných mAb vedl pH gradient k lepšímu rozlišení než solný gradient, což se projevilo vyššími rozdíly retenčních časů mezi kyselými, hlavními a zásaditými variantami (∆RT1-2 a ∆RT2-3). Optimalizace pomocí polovičního gradientu (0–50 % B) dále zvýšila separaci nejbližších variant. Solný gradient vyžaduje individuální ladění pH a solné koncentrace pro každou protilátku, kdežto pH gradientová metoda funguje jako platforma se snadnou a rychlou optimalizací.

Přínosy a praktické využití metody

• Univerzální platforma pro široké spektrum mAb bez nutnosti rozsáhlého ladění.
• Rychlá optimalizace rozlišení díky lineární pH gradientu.
• Vyšší rozlišovací schopnost vůči konvenčním solným gradientům.
• Možnost kontinuální kontroly kvality v režimu QC/QA i ve vývojových laboratořích biosimilars.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o propojení s hmotnostní spektrometrií pro detailní identifikaci modifikací. Dále je možné implementovat plně automatizované pracovné postupy pro vysokoprůchodovou analýzu většího počtu vzorků. Vývoj nových pufrů a materiálů kolón může prodloužit rozsah pH a zlepšit stabilitu metody.

Závěr

Lineární pH gradientová chromatografie na kolóně MAbPac SCX-10 představuje robustní a vysoce rozlišenou platformní metodu pro analýzu nábojových variant monoklonálních protilátek. Ve srovnání s tradičními solnými gradienty přináší výrazně lepší separaci variant a usnadňuje validaci i rutinní QC metod pro originální i biosimilars produkty.

Reference

1. Top 50 pharmaceutical products by global sales. PMLive, 2013.
2. Lin S, Baek J, Decrop W, Rao S, Agroskin Y, Pohl C. Development of a cation-exchange pH gradient separation platform. Presented at 39th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques; Amsterdam, Netherlands; 16–20 June 2013.
3. Vlasak J, Ionescu R. Heterogeneity of monoclonal antibodies revealed by charge-sensitive methods. Current Pharmaceutical Biotechnology. 2008;9:468–481.