A Peptide Mapping “How to” Guide

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčová metoda pro charakterizaci proteinů v biotechnologii a farmaceutickém vývoji. Umožňuje ověřit primární strukturu rekombinantních proteinů, detekovat drobné aminokyselinové mutace, posttranslační modifikace (oxidace, deamidace, glykosylace apod.) a zajišťuje sledovatelnost kvality v průběhu výrobního procesu. Díky vysokému rozlišení i citlivosti poskytuje komplexní „otisk“ proteolytického digestu, který je nezbytný pro potvrzení identity, konzistence a genetické stability terapeutických proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Tento „how-to“ průvodce shrnuje zásady úspěšného provedení peptidového mapování na bázi reverzní fáze HPLC a jeho následné analýzy hmotnostní spektrometrií. Představuje krok za krokem optimalizaci jednotlivých etap: přípravu vzorku, volbu štěpného činidla, redukci a alkylaci, digesci, očistu digestu, chromatografickou separaci a detekci. Důraz je kladen na maximalizaci pokrytí sekvence, opakovatelnost výsledků a integraci s vysoce výkonnými LC-MS systémy.

Použitá metodika a instrumentace

Peptidové mapování probíhá ve čtyřech hlavních fázích:

• Příprava vzorku – deplece/obohacení (MARS kolony), dialýza/desalting (SEC kolony, spin-filtry PES).
• Enzymatická štěpná reakce – trypsin (Agilent Proteomics Grade) při pH 7,5–8,0, 37 °C, 4–18 h.
• Redukce a alkylace – DTT (200 mM) a IAM v temnu pro zablokování SH skupin.
• Čištění digestu – C18 spektrální špičky (Bond Elut OMIX Tips) nebo SPE destičky (AssayMAP).

Chromatografická separace na reverzní fázi využívá kolony AdvanceBio Peptide Mapping (2,1 × 100–250 mm, 2,7 µm) nebo RRHD 300 SB-C18 (1,8 µm) při 0,3–0,6 mL/min, 40–60 °C s gradientem voda/ACN + 0,1 % TFA. Detekce UV 210–220 nm a 280 nm, volitelné paralelní sledování. Pro MS analýzu jsou nasazovány Agilent 1290/1200 Infinity LC systémy spojené s Q-TOF (6520, 6550 iFunnel) či ESI-MS a MALDI-TOF.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace gradientu, teploty a délky kolony dovoluje rozlišení přes 100 peptidových píků a 100% pokrytí sekvence (příklad EPO digest).
• Zvýšení teploty na 60 °C a prodloužení gradientu zlepšuje selektivitu a špičkový tvar (myoglobin digest).
• Reprodukovatelnost separací (CV < 1–3 %) potvrzena při pěti po sobě jdoucích injekcích i mezi dny.
• Automatizovaná příprava na platformě AssayMAP snižuje variabilitu (< 4 % CV), zkracuje dobu přípravy a zvyšuje throughput (až 384 vzorků/den).

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní potvrzení identity proteinu a detekce citlivých PTM pro QC v biopharmaceutické výrobě.
• Komparativní analýza pro ověření konzistence procesů a stability výrobku.
• Integrace s LC-MS/MS zajišťuje přesné dávkování, sekvenční pokrytí a rychlou detekci degradací.
• Automatizace přípravy umožňuje vysokou propustnost i ve vysoce regulovaných prostředích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• (Sub-)mikro-/nano-flow LC-MS spojené s povrchově porézními kolony pro rychlejší a citlivější analýzu peptidů.
• Další automatizace a robotizace (AssayMAP, on-line přenos vzorků) pro velkokapacitní screening.
• Pokročilá softwarová řešení a strojové učení pro optimalizaci metod a interpretaci masových spekter.
• Potential rozšíření do nativního MS, glykoproteomiky a cílené kvantifikace PTM z biofluid.

Závěr

Peptidové mapování na bázi reverzní fáze HPLC s následnou MS detekcí představuje zlatý standard pro charakterizaci proteinů v biotechnologickém výzkumu i výrobě. Systematický přístup k přípravě vzorku, enzymatické digesci, chromatografii a analýze zabezpečuje opakovatelnost a vysoké pokrytí sekvence. S rozvojem pokročilých kolonových technologií a plně automatizovaných platforem se zvyšuje throughput, citlivost i spolehlivost výsledků. Tato metoda nadále zůstane nezbytným nástrojem pro QC, vývoj a validaci proteinových terapeutik.

Reference

• Agilent Application Note: "Keys for enabling optimum peptide characterizations: A Peptide Mapping 'How to' Guide."