Identification of Conjugation Sites in an Antibody Drug Conjugate

Význam tématu

\n
\nADC jsou moderní bioterapeutika spojující monoklonální protilátku s cytotoxinem. Peptidové mapování ADC je klíčové pro charakterizaci heterogenity konjugací a zajištění kvality, účinnosti a bezpečnosti.\n\n

Cíle a přehled studie

\n
\nCílem bylo lokalizovat a identifikovat konjugovaná lyzinová rezidua v ADC T-DM1 pomocí plně automatizovaného analytického workflow. Studie zahrnuje přípravu vzorku, chromatografickou separaci, hmotnostní spektrometrii a bioinformatickou analýzu.\n\n

Použitá instrumentace

\n
\n

\n
• Agilent AssayMAP Bravo protein sample prep platform
\n
• Agilent 1290 Infinity II bio LC system (pumpa, multisampler, termostat, DAD detektor)
\n
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI zdrojem
\n
• Softwary: VWorks 14.1, MassHunter DA 11.0, BioConfirm 12.1
\n

\n\n

Použitá metodika

\n
\nAnalýza probíhala následovně:\n

\n
• Denaturace v 8 M močovině, redukce DTT, alkylace IAA
\n
• Trypsinové štěpení na platformě AssayMAP Bravo
\n
• RP-LC na AdvanceBio peptide map kolonce (2.1×150 mm, 60 °C, gradient 3–45 % ACN)
\n
• MS/MS akvizice v pozitivním módu (m/z 300–1700, Top10 DDA, 2 GHz, cíl 25 000 cps)
\n
• Analýza dat v MassHunter BioConfirm: modifikace MCC-DM1 (+956,3644 Da), tolerance ±20 ppm MS, ±50 ppm MS/MS
\n

\n\n

Hlavní výsledky a diskuse

\n
\nBioConfirm automaticky lokalizoval 26 z 44 dostupných lysinů s připojeným DM1-linkerem s průměrným pokrytím 94 % a hmotnostní přesností <3 ppm. UV chromatogramy (214/252 nm) a EIC iontu m/z 547,22 prokázaly oddělení konjugovaných peptidů s vyšší hydrofobicitou. Identifikována byla stereoisomerie DM1 (duplety v EIC) a charakteristické fragmenty DM1 (m/z 140,07; 453,19; 485,22).\n\n

Přínosy a praktické využití metody

\n
\n

\n
• Automatizovaná příprava a akvizice zkracují dobu analýzy a zlepšují reprodukovatelnost (RT RSD <0,3 %, signál RSD ~5 %).
\n
• Detailní charakterizace heterogenity ADC podporuje kontrolu kvality a vývoj nových terapeutik.
\n
• Workflow je vhodný pro validaci výrobních procesů ADC ve výzkumu i průmyslu.
\n

\n\n

Budoucí trendy a možnosti využití

\n
\nS nástupem iontové mobility, vyššího rozlišení MS a strojového učení se očekává zvýšení citlivosti analýzy, rychlejší multiplexní zpracování a automatizovaná interpretace dat. Integrace klinických dat povede k personalizovaným ADC terapiím.\n\n

Závěr

\n
\nAgilent peptide mapping workflow pro T-DM1 prokázal vysokou přesnost a reprodukovatelnost při identifikaci 26 konjugovaných lysinů. Kombinace AssayMAP Bravo, 1290 Infinity II bio LC, 6545XT LC/Q-TOF a BioConfirm softwaru nabízí efektivní nástroj pro vývoj a kontrolu kvality ADC.\n\n

Reference

\n
\n

\n
1. Wu G. et al. Study on the Heterogeneity of T-DM1 and the Analysis of the Unconjugated Linker Structure under a Stable Conjugation Process. ACS Omega, 2019, 4, 8834–8845.
\n
2. Lewis Phillips G.D. et al. Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1, an Antibody–Cytotoxic Drug Conjugate. Cancer Res., 2008, 68, 9280–9290.
\n