From HPLC to UHPLC: How fast can I be, and does fastest always mean best?

Význam tématu

UHPLC představuje moderní přístup k kapalinové chromatografii s důrazem na zkrácení doby analýzy, zvýšení rozlišení a snížení spotřeby elučního činidla a vzorku. V praxi se široce využívá v oblasti farmacie, potravinářství, environmentálních analýz i metabolomiky, kde nabízí vysokou produktivitu a lepší detekční limity.

Cíle a přehled studie

Studie zkoumá možnosti zrychlení separací přechodem z konvenční HPLC na UHPLC. Analyzuje vliv velikosti částic a délky kolony na účinnost, rozlišení a tlak podle teorie van Deemtera a Purnellovy rovnice. Dále představuje principy škálování gradientu pro zachování selektivity při vyšších rychlostech.

Použitá metodika a instrumentace

• Teoretický rámec: van Deemterova a Purnellova rovnice, tlaková závislost ∆p ~ 1/dp²
• Gradientní objemový koncept (VG/VC) pro přepočet gradientních programů
• Přístroj: Thermo Scientific Vanquish UHPLC systém s maximálním tlakem až 1000 bar
• Kolony: ProntoSIL 120 C18 AQ s částicemi 10, 5, 3 a 2 µm
• Mobilní fáze: acetonitril/voda 20/80 (v/v) v isokratickém a gradientním režimu
• Teplota provozu: 20–100 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Z experimentů vyplývá, že při zachování konstantního poměru L/dp lze přejít z 10 µm na 5 µm částice a zrychlit analýzu až 4× bez snížení rozlišení. Při 3 µm částicích a kompenzaci délky kolony je možné dosáhnout až 11× zrychlení. Teoretická úvaha ukázala potenciál až 60× zrychlení za cenu kompromisu v kvalitě separace. V gradientních metodách lze zachovat relativní retence a rozlišení pomocí úprav gradientního objemu a rychlosti průtoku.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy a vyšší průchodnost vzorků
• Snížení spotřeby elučního činidla a objemu vzorku
• Zlepšení detekčních limitů a reprodukovatelnosti
• Využití v QA/QC laboratořích, farmaceutickém vývoji, environmentálních a bioanalytických aplikacích

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj UHPLC systémů pro tlak nad 1500 bar, aplikace sub-2 µm částic, integrace mikroprůtokových systémů a spojení s hmotnostní spektrometrií. Trendem je také zelená analytika s redukcí rozpouštědel a automatizované workflow.

Závěr

Optimalizace rychlosti a kvality separace spočívá v kombinaci délky kolony, velikosti částic a gradientního objemu. UHPLC rozšiřuje možnosti chromatografie, přičemž vyšší tlak zůstává cenou za dosažení vyššího výkonu. Systematické škálování umožňuje volbu nejvhodnějšího kompromisu mezi rychlostí a rozlišením podle analytických požadavků.