From HPLC to UHPLC: What are the Instrumental Requirements and Pitfalls?

Význam tématu

V přechodu z klasického HPLC na moderní UHPLC hraje klíčovou roli optimalizace instrumentálního uspořádání. Snižování rozměrů částic i průměru kapilár umožňuje výrazné zkrácení doby analýzy, vyšší rozlišení a snížení spotřeby elučních činidel i vzorku. Cílem je maximalizovat rychlost a efektivitu separace bez zhoršení citlivosti a reprodukovatelnosti.

Cíle a přehled studie

Článek rozebírá hlavní požadavky a úskalí při implementaci UHPLC. Zabývá se vlivem gradient delay volume (GDV), extra column volume (ECV), volbou detekčního systému, hydraulickými parametry a správnou konstrukcí kapilár a spojů. Poskytuje praktické rady pro přenos metod mezi různými systémy.

Použitá metodika

Studie vychází z experimentů s různými HPLC a UHPLC systémy Thermo Scientific. Analýzy zahrnovaly:

• měření GDV a ECV u pump, autosampleru, termostatu a detektoru,
• testy účinku různých kapilárních průměrů a délky na efektivitu,
• hodnocení vlivu detekční cely, datového kmitočtu a časové konstanty na kvalitu špiček,
• porovnání separací na plně pórových a pevnostěnných částicích (core–shell).

Použitá instrumentace

Analýzy byly provedeny na systémech Vanquish UHPLC (Horizon, Flex Binary a Quaternary) od Thermo Fisher Scientific s detektory UV/VIS (variabilní vlnová délka) a LC–MS konfiguracemi. Použity byly kapiláry PEEK a Viper fittingy, speciální UHPLC kolony (2,1 × 100 mm, 2,6 µm) i standardní HPLC kolony (4,6 × 100 mm, 5 µm).

Hlavní výsledky a diskuse

1. Gradient Delay Volume (GDV):

• Menší GDV zkracuje dobu equilibrace kolony a umožňuje kratší metody s vysokou průchodností.
• Větší GDV vyžaduje minimalizovat izokratickou fázi a zkrátit předkolonové kapiláry.

2. Extra Column Volume (ECV):

• Příliš velké ECV vede k rozšíření špiček a poklesu efektivity zejména u mikrokolon.
• Optimalizace průměru kapilár a použití Viper fittingů omezují mrtvý objem.

3. Detektor a nastavení datového kmitočtu:

• Objem retenčních špiček musí být ~10× větší než objem detekční cely.
• Doporučená rychlost záznamu je ≥10 Hz a časová konstanta nastavená tak, aby špičky byly reprezentovány 30–40 body.

4. Core–shell technologie:

• Přechod z plně pórových na pevnostěnné částice přináší vyšší rychlost separace za nižšího tlaku, avšak vyžaduje optimalizaci hydrauliky systému.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované UHPLC umožňuje výrazně zkrácené analýzy, úsporu elučních činidel až o 50 %, snížení spotřeby vzorku a zlepšení rozlišení. To přináší vyšší denní propustnost laboratoře, rychlejší rozhodování v QA/QC aplikacích i širší možnosti sledování terapeutických a environmentálních vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Zásadní bude další miniaturizace fluidiky, vyšší provozní tlaky nad 1500 bar, sofistikovanější detektory s rychlejším sběrem dat a inteligentní software pro automatizovanou optimalizaci metod. Rozvoj mikrofluidických čipů a kombinace UHPLC s vysoce citlivou hmotnostní spektrometrií otevřou nové aplikační možnosti v proteomice, metabolomice a farmaceutickém výzkumu.

Závěr

Přechod z HPLC na UHPLC přináší značné výhody v rychlosti a efektivitě separací, ovšem vyžaduje důkladné zvládnutí gradient delay volume, extra column volume i detekčních parametrů. S vhodnou instrumentální konfigurací a správným nastavením lze dosáhnout vysoké propustnosti bez kompromisů v kvalitě analýzy.

Reference

Dr. Markus M. Martin: From HPLC to UHPLC: What are the Instrumental Requirements and Pitfalls?, Thermo Fisher Scientific 2019.